Враг моего врага - мой друг

Микробиология Бактериофаги вирусология вирусы

Автор: old.medach.pro

Публикация: 18.02.2018

ХХ столетие называют веком атома, нейлона и антибиотиков. С началом массового применения пенициллина в 1943 году медики всего мира получили мощнейший механизм для защиты организма от атак, казалось бы, всех болезнетворных бактерий. И ученые, подхватив знамя антибиотикотерапии, ринулись на поиски и разработку новых природных и синтетических антибактериальных средств. Но, если мирный атом и синтетические материалы оправдывают своё применение, то надежды на всемогущество антибиотиков, увы, тают с каждым годом: резистентность бактерий становится всё шире, ученые и врачи бьют тревогу. 16 сентября 2000 года на Всемирном Дне Резистентности в Торонто была принята Декларация по борьбе с бактериальной резистентностью, а 11 сентября 2001 г. Всемирная Организация Здравоохранения опубликовала Глобальную стратегию по сдерживанию резистентности к противомикробным препаратам, в тексте которой есть такие строки: "Без согласованных действий всех стран многие великие открытия, сделанные учеными-медиками за последние 50 лет, могут утратить свое значение из-за распространения антибиотикорезистентности". Означает ли это, что мы в скором времени вновь окажемся бессильны перед бактериями? Существует ли альтернатива антибиотикам в борьбе с инфекционными заболеваниями? К счастью, существует: бактериофаги - самая многочисленная, самая древняя и распространенная на нашей планете вирусная формы жизни, существующая на Земле свыше трех миллиардов лет и неоправданно заброшенная исследователями в 1960-70 годы на фоне успехов волны антибиотикотерапии.

Открытие

Несомненно, многие бактериологи наблюдали и описывали проявления действия фага на бактериальные культуры. В 1896 г. английский бактериолог Э.Ханкин, исследуя антибактериальное действие воды индийский рек, описал агент, проходящий через бактериальные фильтры и вызывающий лизис бактерий. Российский микробиолог Н. Ф. Гамалея в 1897 году наблюдал явление лизиса бацилл сибирской язвы. Однако, первая научная публикация о фагах - статья английского микробиолога Ф. Туорта 1915 года, в которой он описал инфекционное поражение стафилококков, вызывавшее значительные изменения морфологии колоний. Инфекционный агент свободно проходил через бактериальные фильтры, и его можно было переносить из одной колонии в другую. Туорт выдвинул несколько гипотез, объясняющих это явление, в частности - гипотезу о фильтрующемся вирусе, подобном вирусам растений и животных. Однако его работа не привлекла внимания ученых, а Туорт забросил её в связи со службой в армии. В 1917 г. канадский бактериолог Ф.Д'Эрелль, независимо от Туорта сообщил об открытии бактериофага. У микробиологов того времени существовало предположение, что чума свиней вызывается совместным действием микроба и вируса. Д'Эрелль предположил, что схожая этиология и у дизентерии. С помощью свечей Шамберлена он отфильтровал фекалии больных дизентерией и добавил их к культурам шигелл, намереваясь ввести предполагаемую смесь бактерий и вируса экспериментальным животным. Однако, на следующие сутки он обнаружил, что бульон, в котором росли шигеллы, стал прозрачным, что свидетельствовало о гибели бактерий в данных пробирках. Профильтровав бульон из этих пробирок, он снова заразил полученными фильтратами культуры шигелл. И вновь на следующие сутки он обнаружил, что бульон стал прозрачным. Обнаруженное "литическое начало" можно было бесконечно пассировать от одной культуры к другой, что привело Д'Эрелля к мысли о существовании вируса, разрушающего бактерии. В дальнейшем он обнаружил фаги стафилококков, холерного вибриона и сальмонеллы. Учитывая эффективность фагов против патогенных микроорганизмов и их широкое распространение в природе, Д'Эрелль предположил, что они играют определенную роль в развитии иммунитета к инфекционным заболеваниям и выздоровлении. В 1920-40 годы было проведено множество исследований по клиническому применению бактериофагов, однако стабильных результатов получено не было, и на западе бактериофаги, в основном, стали объектом изучения биологов. В 1931 г. Совет фармации и химии Американской медицинской ассоциации опубликовал обзор 150 работ по фаготерапии, в котором M. Итон и С. Бэйн-Джонс утверждали, что природа фага неживая; возможно, это фермент, и ошибочно связывать воздействия фага на бактерии или его терапевтическое действие с его жизнедеятельностью. Эти выводы оказали сильное негативное влияние на капиталовложения в исследования по медицинскому применению фагов на Западе. В СССР в ранние годы бактериофагам уделялось достаточное внимание. В 1923 году грузинский микробиолог Г.Г. Элиава, ученик Д'Эрелля, основал в Тбилиси Институт бактериофагов, ставший впоследствии Всесоюзным центром фаготерапии, коллекция которого на сегодняшний день составляет около 3000 фаговых штаммов, активных в отношении различных микроорганизмов. Однако, успешное применение антибиотиков в 1960-70 годы практически похоронило идеи фаготерапии. Так, например, в Большой советской энциклопедии, указано: "Антибиотики и другие химиотерапевтические средства оказались эффективнее фагов, в связи с чем их применение с лечебной целью сузилось".

Происхождение

Вопросом о природе бактериофага задавался еще Туорт в своей первой статье. Д'Эрелль в своем фундаментальном труде выдвинул несколько теорий происхождения фагов, из которых две сохранили свое значение до настоящего времени: «теория вируса» и «регрессивная теория». Согласно вирусной теории, бактериофаги, подобно вирусам растений и животных, рассматриваются как прямые потомки неких очень примитивных форм, существовавших еще до появлений клеток, представляют собой автономные микроорганизмы, которые являются облигатными паразитами бактерий. Этой теории придерживался Д'Эрелль в самом начале своих исследований, и ее принимало как нечто само собой разумеющееся большинство вирусологов. Но эта концепция, по сути, мало что дает, так как в применении к вирусам такие термины, как автономность и паразитизм, трудно поддаются определению, а сама гипотеза сложно доказуема, поскольку нет ископаемых останков вирусов, а их родственные связи можно изучать только методами молекулярной филогенетики. Согласно регрессивной гипотезе, фаги постепенно развивались из более сложных форм жизни путем утраты всей протоплазмы, ненужной для присущего бактериофагу способа существования. Данная гипотеза лучше вписывается в современную биологию, так как промежуточные стадии процесса дегенерации довольно легко себе представить, а постепенную утрату бактериями способности к синтезу можно изучать экспериментально. Вполне возможно, что бактериофаги произошли из примитивного полового аппарата бактерий, первоначально развившегося для передачи генетического материала от одной бактериальной клетки к другой. Это объясняет, почему некоторые фаги и в настоящее время способны выполнять эту функцию путем лизогенной конверсии. Таким образом, их генетический материал представляет собой модифицированный генетический материал бактерий, сохранивший сходство с гомологичным участком этого материала, для того чтобы вступать с ним в рекомбинации или даже замещать его, что объясняет свойства умеренного фага, который может соединяться с определенными локусами клетки-хозяина, становясь частью ее наследственного аппарата. В процессе эволюции, умеренные фаги могли, путем дальнейших мутаций, влияющих на спектр литического действия, необратимо превращаться в вирулентные, приобретая способность поражать хозяев, с которыми они не имели генетического родства. Согласно этой гипотезе различные штаммы фагов совершенно независимы друг от друга в филогенетическом отношении, и определенный фаг может быть филогенетически ближе клетке-хозяину, нежели к другим фагам. Отсюда следует, что если данная гипотеза верна, между бактериофагами и вирусами животных и растений нет филогенетического родства, а фенотипическое сходство чисто внешне и обусловлено сходной экологией.

Строение

На протяжении почти 70 лет бактериофаги, как и другие вирусы, были для биологов такими же невидимыми, как атомы для физиков в силу их субмикроскопических размеров. И только в 1942 году, с помощью недавно изобретенного (М. Кнолль, Э. Руска, 1931 г.) электронного микроскопа, сотрудники фирмы RCAС. Лурия и Т.Андерсон, получили первые фотографии бактериофага Т2 (или "анти-коли РС", как его называли Лурия и Андерсон).

Рис. 1. Первая в мире фотография бактериофага Т2, полученная с помощью просвечивающего электронного микроскопа, С. Лурия, Т. Андерсон, научно-исследовательские лаборатории RGA, Камден, шт. Нью-Джерси, 2 марта 1942 г.

Рис. 2. Фотография бактериофага Т2 в культуре Escherichia coli. Просвечивающий электронный микроскоп, С. Лурия, Т. Андерсон, научно-исследовательские лаборатории RGA, Камден, шт. Нью-Джерси, 2 марта 1942 г.

Рис. 3. Фотография бактериофага Т2. Просвечивающий электронный микроскоп, С. Лурия, Т. Андерсон, Институт раковых исследований, Филадельфия, шт. Пенсильвания, 29 марта 1962

Рис. 4. Микрофотография фага Т2, сканирующий электронный микроскоп. Фаги весьма разнообразны по морфологии в отличие от вирусов животных и растений. Все известные в настоящее время вирусы эукариот имеют либо форму многогранника, либо спиралевидный тип симметрии. Что же касается фагов, то среди них встречаются формы, имеющие как спиралевидный, так и кубический тип симметрии, а подавляющее число изученных в настоящее время фагов сочетает в одной частице оба типа - кубический у головки и спиралевидный у отростка. Столь своеобразное строение фагов, отличающее их от других вирусов, объясняется наличием у бактерий ригидной клеточной стенки, которая исключает возможность проникновения фагов в клетку путем пиноцитоза или виропексиса и способствовала формированию у фагов других способов инфицирования, что и нашло отражение в их структуре. Именно морфология легла в основу современной классификации бактериофагов. Казалось бы, наиболее целесообразно разделять фаги по принципу их связи с определённым видом микроорганизма, который они поражают (что и легло в основу первых классификаций). Но данный принцип не обеспечивает необходимой точности, так как один штамм фага может иметь широкий литический спектр, поражая различные микроорганизмы. Кроме того, один вид бактерий может поражаться несколькими фагами, различающимися между собой по целому ряду свойств, в том числе морфологически, в то время как фаги, активные в отношении разных видов и родов микроорганизмов, могут быть морфологически тождественны. Были попытки классифицировать фаги по сумме различных признаков (антигенных, физиологических, биохимических, физико-химических, морфологии негативных колоний, спектру литического действия и т. п.). С развитием электронной микроскопии появилась возможность классифицировать фаги по морфологии, Д.Бредли в 1965 г. предложил разделить фаги на шесть морфологических групп (вторая используемая классификация, предложенная А.С.Тихоненко (1968), объединяет фаги D и E групп в одну):

Группа по Бредли	Группа по Тихоненко	Морфология	Тип нуклеиновой кислоты
A	V	С сокращающимся отростком	Двуцепочечная ДНК
B	IV	С длинным несокращающимся отростком	Двуцепочечная ДНК
C	III	С коротким несокращающимся отростком	Двуцепочечная ДНК
D	II	Без отростка, с капсомерами	Одноцепочечная ДНК
E	II	Без отростка и капсомеров	Одноцепочечная РНК
F	I	Нитевидные	Одноцепочечная ДНК

Рис. 5. Схематическое изображение фаговых морфогрупп по Бредли (1965)

Рис.6. Схематическое изображение фаговых морфогрупп по Тихоненко (1968)

Рис. 7. Различные морфоварианты бактериофагов

Рис. 8. Микрофотография фага 1997 Yersinia enterocolitica с длинным несокращающимся чехлом

Рис. 13.Схема строения бактериофага. Большинство фагов состоят из головки диаметром 45-140 нм и отростка толщиной 10-40 нм и длиной 100-200 нм. Нитевидные фаги имеют размер 8х800 нм. Содержимое головки состоит преимущественно из плотно упакованной ДНК или, реже, РНК, длина нити которой во много раз превышает размер головки и достигает 60-70 мкм (см. рис. 14.) и небольшого количества (около 3%) белка, представленного ферментом транскриптазой. Капсид представляет собой белковую или липопротеиновую оболочку, собранную из множества копий одного или двух белков. Капсид может быть икосаэдрическим, сферическим, лимоновидным или плеоморфным. Отросток, представляет собой белковую трубку, окруженную у ряда бактериофагов чехлом, состоящим из сократительных белков, подобных мышечным, благодаря чему способен сокращаться, обнажая часть стержня. В основании отросток содержит фермент АТФазу, который регенерирует энергию для инъекции нуклеиновой кислоты в бактерию и лизоцим, служащий для растворения бактериальной стенки. На конце отростка у многих фагов имеется базальная пластинка с несколькими шиловидными выростами. От пластинки отходят тонкие длинные нити, которые способствуют прикреплению фага к бактерии.

Рис. 14. Микрофотография бактериофага с освободившейся нитью ДНК. Бактериофаги довольно устойчивы к воздействию различных химических и физических факторов. Они устойчивы в пределах рН 5,0-8,0, большинство из них резистентно к действию холодных водных растворов глицерина и этанола, а также цианидов, фторидов, динитрофенола, хлороформа, тимола и фенола. Бактериофаги хорошо сохраняются в лиофилизированном состоянии, но разрушаются при кипячении, под действием УФ облучения, кислот, химических дезинфектантов и формалина. Они хорошо сохраняются при низких температурах (до - 200 оС в глицерине), но быстро инактивируются при 65-70 оС.

Взаимодействие с бактерией

Фаги являются облигатными внутриклеточными паразитами, так как у них отсутствуют механизмы для выработки энергии и рибосомы для синтеза белка. Размножение фага происходит только внутри и посредством бактерии-хозяина. По характеру взаимодействия фага с бактериями различают вирулентные и умеренные фаги. Взаимодействие вирулентного бактериофага с клеткой происходит по литическому пути и складывается из нескольких стадий: адсорбции его на клетке, проникновения в клетку, биосинтеза компонентов фага и их сборки и выхода бактериофагов из клетки.

Рис. 15. Адсорбция фага PIcmlclr 100ts на поверхности Yersinia pestis.

Первоначально фаг прикрепляется к фагоспецифическим рецепторам на поверхности бактериальной клетки. Например, рецепторы для фагов Т3, Т4 и Т7 расположены в липополисахаридном слое, для Т2 и Т6 — в наружной мембране. На бактериях без клеточной оболочки (протопласты, L-формы) фаги не адсорбируются. Некоторые из них в качестве рецепторов используют F-пили. Помимо рецепторов, адсорбция фага зависит от рН среды, температуры, наличия катионов и некоторых соединений (например, триптофана для Т2-фага). При избытке фага на одной клетке может адсорбироваться до 200–300 вирусных частиц. Отросток фага с помощью лизоцима локально растворяет оболочку клетки. Одновременно в чехле высвобождаются ионы Са2+, активизирующие АТФазу, что вызывает сокращение чехла, вталкивание стержня отростка через цитоплазматическую мембрану в клетку и инъецирование в клетку ДНК (или РНК). С момента попадания фаговой ДНК в бактериальную клетку и до полного созревания в ней частиц фага проходит определённый отрезок времени, называемый латентным. Каждая система бактерия-фаг имеет свой определённый латентный период. Введенная ДНК фага вызывает полную перестройку метаболизма бактерии: прекращается синтез клеточной ДНК, РНК и белков. ДНК бактериофага начинает транскрибироваться с помощью собственного фермента транскриптазы, который активируется после попадания в бактериальную клетку. Синтезируются иРНК, которые поступают на рибосомы бактерии, где синтезируются ранние (ДНК-полимеразы, нуклеазы) и поздние (белки капсида и отростка, лизоцим, АТФаза и транскриптаза) белки бактериофага. Репликация ДНК бактериофага осуществляется с участием собственной ДНК-полимеразы. После синтеза поздних белков и завершения репликации ДНК, они соединяются, образуя зрелые инфекционные фаговые частицы. Продолжительность данного процесса может составлять от нескольких минут до нескольких часов. Затем происходит лизис клетки, и выход зрелых бактериофагов. При этом в зависимости от типа фага количество образовавшихся фаговых частиц будет различным - от единичных частиц до нескольких тысяч.

Рис. 16. Лизис E. coli и выход фаговых частиц.

Рис.17. Зрелая форма бактериофага Умеренный фаг инициирует лизогенный цикл, при котором он вместо репликации обратимо взаимодействует с геномом к бактерии-хозяина, интегрируясь в хромосому или сохраняясь в виде плазмиды. В результате, ДНК фага реплицируется синхронно с ДНК бактерии и при делении передается дочерним клеткам. Такое состояние фага называется профаг. Бактерия, содержащая профаг, становится лизогенной до тех пор, пока при определённых условиях или спонтанно профаг не будет стимулирован на осуществление лизирующего цикла репликации. Переход от лизогении к лизису называется лизогенной индукцией или индукцией профага. На индукцию фага оказывает влияние состояние клетки хозяина, наличие питательных веществ, условия внешней среды и т.д.

Рис 18. Дефектные фаги - пиоцины. Иногда формируются в результате инициации лизогенного цикла умеренным фагом, когда по каким-либо причинам повреждается или блокируется участок ДНК, ответственный за синтез капсида. При этом формируется множество отростков, которые разрушают с помощью лизоцима клеточную стенку бактерии и выходят наружу. Размножаться такие фаги не могут, так как из-за отсутствия головки их ДНК остается внутри бактерии, однако способны лизировать бактерии. Установлено, что некоторые бактериоцины бактерий - не что иное, как дефектные фаги. Важным свойством бактериофагов является их специфичность: бактериофаги лизируют определённый вид бактерий. Существуют также типовые бактериофаги, лизирующие варианты внутри вида (например, фаги V. cholerae classica и El-tor) и поливалентные бактериофаги, которые лизируют бактерии разных видов.

Бактериальный иммунитет

Казалось бы: если бактериофаги атакуют абсолютно все бактерии и их численность настолько велика (в биосфере Земли бактериофаги – самые многочисленные вирусные формы, их общее количество – 10^30 фаговых частиц, что примерно равно количеству бактерий (4—6·10^30)), то почему они до сих пор не уничтожили всех бактерий? Ответ очевиден: в процессе эволюционного соразвития бактерии выработали иммунитет против фагов. В 2005 году стало известно, что функциональной основой бактериального иммунитета является система CRISPR, а в 2012 г. было установлено, что для работы данной системы необходимо наличие белка Cas9. Работа системы CRISPR-Cas основана на том, что небольшой фрагмент, вырезанный из проникшей в бактериальную клетку фаговой ДНК, вставляется в специальный участок (локус CRISPR) генома бактерии. Каждый локус CRISPR содержит множество таких вставок (спейсеров), представляющих собой фрагменты ДНК всех встреченных когда-либо фагов, плазмид, мобильных генетических элементов. На основе спейсеров синтезируются молекулы РНК, комплементарные участку генома фага. Эти РНК в комплексе с белками Cas используются затем для опознавания и обезвреживания чужеродной ДНК с такой же последовательностью нуклеотидов. Таким образом, если в клетку однажды проникла фаговая ДНК, но клетка выжила и встроила фрагмент чужеродного генома в свой нуклеоид, то последующие попытки таких же фагов встроить свою ДНК в геном этой клетку или ее потомков будет неэффективно (более подробную информацию о системе CRISPR можно найти в статье Медача, посвященной этой теме ). Впрочем, бактериофаги, в свою очередь, за счет случайных мутаций и отбора умеют обходить систему CRISPR-Cas. Чтобы данный спейсер потерял свою эффективность, достаточно, чтобы комплементарный ему фрагмент фагового генома хотя бы незначительно изменился. Поэтому фаги успешно и достаточно быстро преодолевают приобретенный иммунитет бактерий за счет точечных мутаций. С другой стороны, системы CRISPR очень широко распространены у бактерий и, судя по всему, обеспечивают своим обладателям надежную защиту. Эффективность системы CRISPR обеспечивается благодаря тому, что даже две разные бактерии одного и того же штамма встраивают в свой геном разные спейсеры, соответствующие разным участкам генома фага. В результате популяция бактерий быстро приобретает генетическое разнообразие, что значительно повышает их шансы на выживание. Точечные мутацию, обходящие один спейсер, позволят фагам заразить только небольшую часть популяции бактерий. К тому же, бактериофаг не может определить заранее, какие спейсеры имеются у конкретной бактерии. Поэтому большинство фагов в полиморфной популяции бактерий погибают, даже при высокой скорости появления точечных мутаций. Данный феномен коллективного бактериального иммунитета был продемонстрирован группой ученых на бактериях Pseudomonas aeruginosa и фагах DMS3vir. Убедившись для контроля, что система CRISPR действительно защищает бактерий от данной разновидности фагов, а культуры бактерий с отключенной системой CRISPR активно поражаются фагом, хотя они тоже выработали форму защиты, но на другой основе: у них распространились мутации, меняющие поверхностный белковый фагоспецифический рецептор, к которому прикрепляется фаг. Однако, данный способ менее эффективен, т.к. по истечение 30 суток эксперимента, бактериофаги все еще находились в популяции. Чтобы доказать, что разнообразие спейсеров системы CRISPR-Cas9 является основой эффективность коллективной иммунной защиты, ученые сравнили устойчивость к фагам у популяций с разным уровнем разнообразия спейсеров. Оказалось, что фаги в монокультурах бактерий уже в первые сутки приобретают мутации, делающие соответствующий спейсер неэффективным. У фагов в бактериальных популяциях, составленных из нескольких клонов с различными спейсерами, устойчивость сформировалась лишь в немногих случаях. В популяциях, составленных из 24 - 48 клонов, фаги не смогли преодолеть систему CRISPR-Cas. Отсюда следует, что в монокультуре единичная мутация, обеспечивающая защиту от конкретного спейсера, позволяет фагу заразить любую бактерию, а в полиморфной культуре из 48 клонов точно такая же мутация обеспечит успех лишь с вероятностью 1/48. Даже при условии, что ДНК фага встроится в бактерию,защиту которой он преодолел, его потомки снова столкнутся с той же проблемой, и она будет усугубляться по мере снижения численности бактерий, чувствительных к данному фагу. Таким образом, точечные мутации и отбор становятся для вирусов недостаточно эффективной эволюционной стратегией, что объясняет эффективность системы CRISPR-Cas и ее широкое распространение у бактерий. В таком случае, почему бактериофаги до сих пор не вымерли, раз эта система так эффективна? Совсем недавно у фагов были обнаружены особые гены, подавляющие систему CRISPR. В таком случае, что могут противопоставить бактерии, если существуют гены, полностью подавляющие CRISPR? Ответ, опять же, в разнообразии: существует много разных вариантов системы CRISPR, каждый из которых уязвим только для некоторых вариантов генов анти-CRISPR и защищен от других. А содержать в своем геноме множество дополнительных генов для бактериофага невозможно, так как отбор у них поддерживает преимущественно компактизацию генома в угоду увеличения скорость размножения. Такая антагонистическая коэволюция фагов и бактерий протекающая параллельно на разных уровнях и в разных временных масштабах (формирование новых спейсеров бактериями - точечные мутации фагов, выработка новых генов анти-CRISPR – формирование новых вариантов системы CRISPR) позволяет соблюдать баланс в системе бактериофаг – бактерия в масштабах как одной популяции, так и биоценоза в целом .

Получение бактериофагов

Бактериофаги широко распространены в природе. Везде, где есть бактерии – есть вирусы-фаги. Их можно выделить из открытых полостей организма человека и животных, водоемов, сточных вод, почвы, из соответствующих культур бактерий и т.д. Большое количество бактериофагов находится в выделениях больных людей и животных, особенно в период выздоровления от инфекционных заболеваний. Таким образом, поиск и выделение новых бактериофагов не представляет трудности. Для выделения бактериофага исследуемый материал (воду, испражнения, гной, почву и др.) засевают в жидкую питательную среду, инкубируют в термостате, и через сутки помутневшую питательную среду пропускают через бумажный, а затем через бактериальный фильтр, асбестовые пластины, керамические свечи. Полученный фильтрат исследуют на наличие бактериофага путем совместного посева с соответствующей микробной культурой на плотные или жидкие питательные среды. При наличии бактериофага после 18-часовой инкубации на поверхности агара, обнаруживается сплошной газон культуры с прозрачными бляшкакми – колониями фага. В бульоне присутствие бактериофага обусловливает просветление среды.

Рис. 19. Фаговые бляшки (зоны лизиса на культуре бактерий) Для выделения чистой культуры бактериофага материал из отдельной бляшки переносят бактериологической иглой в суспензию молодой микробной культуры. Материал из последнего стерильного пятна снова засевают вместе с фагочувствительными микробами на жидкую питательную среду. После 6-18-часовой инкубации среду фильтруют, и получают чистую культуру бактериофага. Для изготовления серийного препарата бактериофага применяются только апробированные штаммы и культуры соответствующих микробов, обладающих типичными морфологическими, биохимическими и серологическими свойствами. Штаммы бактериофагов должны быть музейными и рабочими. Музейные производственные штаммы бактериофагов ежегодно обновляются путем выделения новых или пассажами имеющихся штаммов через организм больного, а также адаптацией к свежевыделенным, резистентным к данному бактериофагу культурам. Промышленное получение бактериофага в настоящее время осуществляется в специальных аппаратах - реакторах, емкостью от 250 до 1000 л, с применением аэрации как фактора, стимулирующего развитие микроорганизмов. В реактор наливается жидкая питательная среда, которая стерилизуется при температуре 110 °С в течение 40 минут. После стерилизации среда охлаждается до 39 °С и засеивается соответствующей микробной культурой и бактериофагом одновременно. Для засева употребляются 18-часовые агаровые культуры, которые прибавляются из расчета 50 млн. микробных клеток на 1 мл среды. Бактериофаг добавляется в количестве не более 0,3 % по отношению к объему питательной среды. Среду с засеянными в ней культурой и бактериофагом оставляют при температуре 37 °С на 6-18 часов. Бактериофаги активно размножаются внутри бактериальных клеток, увеличиваясь в количестве и вызывая их лизис, что внешне проявляется полным просветлением среды. К полученному лизату добавляется в качестве консерванта хинозол (0,01 %) или фенол (0,25 %) и не позже чем через 2 часа после этого содержимое реактора фильтруется через бактериальные фильтры (асбестовые пластины, свечи Шамберлена или свечи ГИКИ соответствующей пористости) для удаления оставшихся микробных клеток. Полученный препарат-бактериофаг должен иметь вид, совершенно прозрачной жидкости желтого цвета. Он проходит контроль на стерильность, безвредность и литическую активность. Безвредность препарата проверяют путем введения животным, например, брюшнотифозный и дизентерийный бактериофаги вводят подкожно трем мышам по 1 мл, либо внутривенно одному кролику 5 мл. Наблюдение за животными ведется в течение 3-4 суток. Литическая активность бактериофага определяется титрованием в жидкой питательной среде методом Аппельмана, на плотной питательной среде - методом Отто. За титр бактериофага при определении методом Аппельмана принимают то наибольшее разведение его, которое вызывает полный лизис тестовой культуры микроорганизмов. После проведения контролей бактериофаг разливается во флаконы нейтрального стекла (по 25, 50 и 100 мл). Помимо жидких препаратов бактериофага могут изготавливаться также и сухие. Для их получения фаголизат осаждается сернокислым аммонием, осадок отделяется от жидкой части, к нему добавляется в качестве стабилизатора 9 % глюконат кальция, смесь тщательно растирается, и лиофилизируется.

Биологическое значение бактериофагов

Бактериофаги выполняют важную роль в контроле численности микробных популяций и переносе бактериальных генов, выступая в качестве основных подвижных генетических элементов и являясь одним из наиболее мощных факторов изменчивости бактерий и актиномицетов, вносят посредством трансдукции в бактериальный геном новые гены: размножаясь в клетке, они способны захватывать некоторые гены бактерии и, инфицируя другую клетку, передают приобретённые гены новому хозяину. Есть все основания предполагать, что большинство микроорганизмов являются лизогенными. Многие лизогенные культуры содержат 2, 3, 4 и более умеренных фагов, т.е. являются полилизогенными. Например, многие актиномицеты, проактиномицеты, клубеньковые бактерии, а также некоторые спороносные бактерии содержат в геноме четыре и более профага. Данное свойство фагов позволило широко использовать их в генной инженерии в качестве векторов, переносящих участки ДНК. Фаговые векторы обычно создают на основе генома бактериофага λ, содержащего двухцепочечную молекулу ДНК. Левое и правое плечи ДНК фага содержат гены, необходимые для репликации, а средняя часть молекулы может быть заменена на интересующий фрагмент чужеродной ДНК. При этом вирус осуществляет встраивание в геном бактерии, и она осуществляет многократное копирование фаговой ДНК с необходимым фрагментом, в качестве которых могут выступать и гены эукариот. Негативным для человека примером фаговой конверсии является описанный в 1951 году феномен переноса умеренным фагом гена tox и включение его в нетоксигенный штамм Corinebacterium diphtheriae, в результате чего он начинает вырабатывать дифтерийный токсин и вызывает заболевание дифтерией. Подобное явление характерно для холерных вибрионов, сальмонелл, клостридии и др. В связи с высокой специфичностью фагов, они применяются также как диагностические препараты для идентификации бактериальных культур в медицинской, ветеринарной, технической микробиологии и фитопатологии. Метод фаготипирования, основанный на исключительной специфичности определенных штаммов бактериофага, позволил распределить на фаготипы ряд штаммов бактерий, которые неотличимы друг от друга по другим признакам. Фаготипирование с успехом применяется при идентификации бактерий брюшного тифа, сальмонелл, стафилококков и ряда других. Этот метод дает возможность эпидемиологам точно проследить за цепочкой заразных заболеваний и определить источник инфекции. Важное значение бактериофаги имеют для быстрого обнаружения небольших количеств патогенных бактерий во внешней среде путем определения нарастания титра специфического бактериофага. Определение колифагов является одним из ключевых параметров в санитарной микробиологии воды и позволяет выявить фекальное загрязнение даже при малом количестве кишечной палочки, не определяемой бактериологическим методом. Бактериофаг применяется и для борьбы с бактериальными вредителями различных технических брожений, и в производстве ферментов, продуцируемых бактериальными культурами. В то же время бактериофаг, заражая промышленные культуры бактерий, является опасным вредителем производственных штаммов (вакцинных, возбудителей молочнокислого, ацетонобутилового и некоторых других брожений, продуцентов антибиотиков), вызывая серьезные нарушения технологического процесса.

Применение бактериофагов в медицине

Первый отчет об успешной фаготерапии был опубликован в 1921 г. Брийонгом и Майсином, которые использовали стафилококковый бактериофаг для лечения кожных заболеваний. Как уже было указано ранее, западная медицина c середины ХХ практически отказалась от использования бактериофагов в терапевтических целях, однако в СССР они довольно широко применялись. Одним из самых, пожалуй, масштабных примеров практического применения фагов является использование комплексного препарата бактериофагов в Сталинграде во время ВОВ. З.В. Ермольева во время работы в Ташкентском институте вакцин и сывороток разработала препарат, содержащий 19 видов бактериофагов, в том числе холерный, брюшнотифозный и дифтерийный. Во время Сталинградской битвы в связи с угрозой эпидемии, в самом Сталинграде было налажено производство препарата и его ежедневно принимали около 50 тысяч человек. После войны в СССР было налажено промышленное производство фаговых препаратов, которое действует и в настоящее время. Основными производителями бактериофагов в РФ являются НПО "Иммунопрепарат" (г.Уфа), Предприятие по производству бактерийных препаратов Им Био (г.Нижний Новгород), МП "Биофон" (г.Саратов), НПО "Биомед" (г.Пермь). На данный момент в России зарегистрировано и производится 13 бактериофаговых препаратов:

Отдельно стоит осветить вопрос применения фаготерапии в западных странах. Хотя частично причины слабого использования бактериофагов в терапевтических целях уже указывались, стоит отметить, что после открытия антибиотиков на западе работы с медицинским применением бактериофагов были полностью свернуты. В последние несколько лет, в связи с увеличением распространенности внутрибольничных инфекций, резистентных к большинству известных антибиотиков, многие западные биотехнологические компании сделали резкий поворот к изучению возможности создания лекарств на основе бактериофагов. Однако, несмотря на существенные технологические преимущества, для успешного создания эффективных лекарств необходима коллекция бактериофагов, действующих на клинически наиболее значимые штаммы возбудителей, и соответствующий опыт их клинического применения, чем западные компании пока не обладают. В начале 2000-х годов Гленн Моррис, сотрудник Мэрилендского университета, совместно с НИИ бактериофагов, микробиологии и вирусологии в Тбилиси наладил испытания фаговых препаратов для получения лицензии на их применение в США. В июле 2007 года бактериофаги были одобрены для использования в США, а вице-президент США Альберт Гор назвал бактериофаги ''новым оружием для борьбы с болезнетворными бактериями''. В настоящее время на западе проходят доклинические испытания ряд препаратов природных и генетичеки модифицированных штаммов бактериофагов, активных в отношении Clostridium difficile и Pseudomonas aeruginosa, но выход препаратов в продажу планируется только в 2023 г. . В то же время есть информация, что проходят и клинические испытания фаговых препаратов. С терапевтической целью бактериофаги применяют самыми разными способами. Для коррекции кишечных дисбиозов жидкие препараты применяют внутрь или per rectum при помощи клизмы. Таблетированные формы принимают внутрь. Также возможно использование бактериофагов в форме ректальных свечей. При кожных и раневых инфекциях их применяют в форме примочек на очаги поражения. При фарингитах, ларингитах и тонзиллитах препараты используют для орошения или полосканий. Для лечения отитов препараты закапывают в уши. При лечении абсцессов практикуют введение в его полость ватного шарика, пропитанного препаратом. Больным, страдающим хроническими остеомиелитами, препарат вводят непосредственно в пораженный участок кости. Также препараты можно вносить в различные полости — брюшную, плевральную и суставные, а также применять в форме аэрозолей при легочных поражениях. При инфекциях мочевыводящих путей бактериофаги вливают непосредственно в пораженный орган с помощью зонда. При гинекологических заболеваниях препарат вливают в матку либо применяют влагалищные тампоны, пропитанные ими. Преимущества Преимущества бактериофагов перед антибиотиками достаточно очевидны и заключаются в следующем:

Бактериофаги способны уничтожать бактерии, устойчивые к антибиотикам;

Свободно проникают в кровь и лимфу и выводятся через почки с мочой. Как показано в ряде исследований, после приема 30 мл бактериофага уже через 2 часа фаговые частицы обнаруживают в моче, а их концентрация в моче достигает максимума через 6–8 часов после приема ;

Не вызывают побочных эффектов и аллергии. Все случаи аллергических реакций при использовании терапевтических бактериофагов были вызваны либо примесями, от которых препарат был недостаточно очищен, либо токсинами, выделяющимися при массовой гибели бактерий (данное явление - реакция Яриша-Герксгеймера - наблюдается и при применении антибиотиков);

Не подавляют рост нормофлоры, не ослабляют иммунитет;

Подходят для пациентов любого возраста, нет противопоказаний;

Можно применять как в виде монотерапии, так и в сочетании с антибиотиками, что значительно снижает риск селекции резистентных штаммов бактерий;
Можно использовать для санации лечебно-профилактических учреждений и для борьбы с госпитальными инфекциями;
Могут применяться для предупреждения инфекционных болезней в эпидемических очагах путем применения бактериофагов среди лиц с высоким риском заражения и имевшими контакт с больным в очаге заболевания.

Недостатки К сожалению, недостатки у бактериофагов также имеются:

Каждый бактериофаг инфицирует только строго определенный вид бактерий а зачастую только определенный штамм, что требует проведение бактериологического исследования биологического материала от больного для фаготипирования, и, хотя в последнее время разрабатываются ускоренные методики определения фаготипа с помощью ПЦР или масс-спектрометрии - внедряются они медленно из-за высокой стоимости и требований к квалификации специалистов.
Для поддержания активности бактериофаги требуют особых условий хранения и транспортировки;
Бактериофаги не активны в отношении внутриклеточных микроорганизмов;
Многих бактериофаги инактивируются в условиях низкого рН желудка при применении препаратов внутрь, а также ингибируются неспецифическим действием различных факторов в жидкостях организма.

Заключение

Прошло уже 100 лет с момента открытия бактериофагов. Неоправданно забытые на западе, и, чудом сохранившиеся в России, они полвека пребывали в тени успеха антибиотикотерапии. Но эпоха антибиотиков оказалась недолгой, и многие ученые и врачи видят в фагах альтернативу для лечения инфекционных заболеваний. Если на сегодняшний день мы имеем штаммы бактерий, устойчивые даже к антибиотикам "последней надежды", то фаги, благодаря описанным выше механизмам коэволюции с бактериями, никогда не утратят актуальности. За 100 лет они были детально изучены, признаны безопасными и стали неотъемлемым инструментом в генетике и биоинженерии, санитарной микробиологии и эпидемиологии, промышленности, медицине и даже в космической сфере (да-да, бактерии с профагом используют для оценки защиты обшивки космических кораблей от радиации). И как нельзя лучше характеризует значение фагов для человека древняя пословица: враг моего врага - мой друг. Автор: Сергей Головин Микрофотографии: Сергей Головин Редакция: Николай Лисицкий, Даня Ряскина, Бровламих Мантис, Елена Лисицына

Источники

1) Декларация по борьбе с антимикробной резистентностью. Ethan Rubinstein, Chaim-Sheba Medical Center, Tel-Hashomer, Israel, Allan R. Ronald, University of Manitoba, Winnipeg, MB, Canada. 2)Стратегия ВОЗ по сдерживанию резистентности к антимикробным препаратам, 2001 г. 3)Ackermann H.-W. // Res. Microbiol., 2003. — V. 154. — P. 245—251. 4)Hendrix R.W. // Theor. Popul. Biol., 2002. — V. 61. — P. 471—480. 5)Félix d'Hérelles (1917). «Sur un microbe invisible antagoniste des bacillesdysentériques» (PDF). ComptesrendusAcadSci Paris. 165: 373–5. 6)Eaton MD, Bayne-Jones S. Bacteriophage therapy. Review of the principles and results of use of bacteriophage in the treatment of infection. JAMA 1934;23:769–1939. 7) Sanjuán R., Nebot M. R., Chirico N., Mansky L. M., Belshaw R. (October 2010). «Viral mutation rates». Journal of Virology 84 (19): 9733–48. 8)Induced Host-Range Mutations in Bacteriophage. Bernal Fernandez, Felix L. Haas, Orville Wyss. ProcNatlAcadSciUSA. 1953 Oct; 39(10): 1052–1057. 9)Ковалёва Е. Н. Создание биопрепарата на основе выделенных и изученных бактериофагов Enterococcusfaecalis: Дис. … канд. биол. наук. — Саратов, 2009. — 151 с. 10)Ackermann H.-W. // Res. Microbiol., 2003. — V. 154. — P. 245—251. 11)Raya R.R., Hébert E.M. Isolation of phage via induction of lysogens. Bacteriophages: Methods and Protocols, Volume 1: Isolation, Characterization, and Interaction (Martha R.J. Clokie, Andrew M. Kropinski (eds.), 2009. — V. 501. — P. 23-32. 12) Микробиология: учеб. пособие / В. В. Лысак. — Минск: БГУ, 2007. — 430 с. 13) Guttman B., Raya R., Kutter E. Basic Phage Biology, in Bacteriophages: Biology and Applications, (Kutter E. and Sulakvelidze A., ed.), CRP Press, 2005 FL. — P. 29-66. 14)Адамс М. Бактериофаги / М. Адамс. — М.: Медгиз, 1961. — 521 с. 15) Suttle C.A. (September 2005), Vuiruses in the sea. Nature 437:356-361. 16) Mojica F. J., Díez-Villaseñor C., García-Martínez J., Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements // Journal of Molecular Evolution. — 2005. — Vol. 60, no. 2. — P. 174—182. 17) Sontheimer E. J., Barrangou R. The Bacterial Origins of the CRISPR Genome-Editing Revolution // Human Gene Therapy. — 2015. — Vol. 26, no. 7. — P. 413—424. 18) http://old.medach.pro/life-sciences/genetika/crispr/ 19) Stineke van Houte, Alice K. E. Ekroth, Jenny M. Broniewski, Hélène Chabas, Ben Ashby, Joseph Bondy-Denomy, Sylvain Gandon, Mike Boots, Steve Paterson, Angus Buckling &Edze R. Westra. The diversity-generating benefits of a prokaryotic adaptive immune system // Nature. 2016. DOI: 10.1038/nature17436. 20) J. Bondy-Denomy et al., Bacteriophage genes that inactivate the CRISPR/Cas bacterial immune system.Nature17 January 2013 - 429–432. 21) http://old.elementy.ru/novosti_nauki/432737/Uchenye_vyyasnili_pochemu_bakteriofagam_trudno_borotsya_s_immunnoy_sistemoy_bakteriy 22)Перетрухина А. Т., Блинова Е. И.Бактерийные и вирусные препараты. Издательство: Академия Естествознания, 2010 г. 23) Dr Lloyd Czaplewski, , Richard Bax, Prof Martha Clokie, Mike Dawson Heather Fairhead, Prof Vincent A Fischetti, Prof Simon Foster, Prof Brendan F Gilmore, Prof Robert E W Hancock, David Harper, Prof Ian R Henderson, Kai Hilpert, Brian V Jones, Prof Aras Kadioglu, David Knowles, Sigríður Ólafsdóttir, David Payne, Steve Projan, Prof Sunil Shaunak, Jared Silverman, Prof Christopher M Thomas, Trevor J Trust, Peter Warn, John H Rex: Alternatives to antibiotics—a pipeline portfolio review. The lancet. - Volume 16, No. 2, p239–251, February 2016. 24) https://vk.com/doc11720814_437567530?hash=9fd774755f985eeaeb&dl=7f9b4f04dd6683f7a3 25) Smith HW, Huggins MB. The control of experimental E. coli diarrhea in calves by means of bacteriophage. J Microbiol 1987;33: 1111–26. 26) Kaczkowski H, Weber-Dabrowska В, Dabrowski M, et al. Use ofbacteriophages in the treatment of chronic bacterial diseases. WiadLek 1990;43:136–41.