Живые фабрики

Учёные разрабатывают клетки, которые могут вырабатывать лекарства, продукты питания и материалы - и даже выступать в качестве диагностических биосенсоров. Но сначала необходимо согласовать между собой набор технических средств.

Введение

С эволюционной точки зрения, дрожжи не смогли бы продуцировать обезболивающие. Но, реинжинировав геном микроба, Кристина Смолки из Стэнфордского университета в Калифорнии заставила их сделать именно это. Смолки и её команда превратила дрожжи в биофабрики, которые, используя сахар в качестве исходного ингредиента, производят в конечном итоге мощное обезболивающее - гидрокодон.

Это достижение является ярким примером из синтетической биологии, науки, занимаясь которой, ученые перепрограммируют клетки для репликации уже существующих в природе веществ - или даже создают более специализированные материалы, которые никогда бы не были произведены организмом в естественных условиях.

Синтетические биологи амбициозны. "Мы все любим представлять себе мир, в котором можно было бы адаптировать биологию для производства любого продукта из возобновляемых, быстро и по первому же требованию", - говорит Майкл Джуэтт, синтетический биолог Северо-Западного университета в Эванстоне, штате Иллинойс. Группы по всему миру реинжинируют геномы дрожжей, бактерий и других клеток, заставляя их вырабатывать пластмассы, биотопливо, лекарства и даже текстиль с целью создания живых заводов - дешевле, проще и устойчивее, чем их промышленные аналоги. Например, биоматериалы компании Spiber Inc., располагающейся в Цуруоке, в Японии, получают путём перепрограммирования бактерий для получения паучьего шёлка, чтобы в дальнейшем производить прочную и легкую зимнюю одежду.

Но синтетические биологи выходят за рамки обычного производства материалов - они создают сложные системы для связи генетических частей в схемах. Такой подход уже привел к появлению различных живых “выключателей” и сложных датчиков. Например, группа Мартина Фасснегера из Швейцарского федерального технологического института (ETH) в Цюрихе разработала встроенные биомедицинские датчики, которые могут обнаружить в крови метаболиты-маркёры заболеваний и вызвать выработку терапевтических соединений. В ходе испытаний на мышах эти биосенсоры успешно предотвратили подагру и ожирение, а также смогли начать лечение псориаза.

В этой молодой отрасли уже произошли несколько историй успеха, но производство и сборка генетических частей в единый механизм в настоящее время влечет за собой существенное количество догадок и непредсказуемость. Для дальнейшего продвижения направления, учёные и промышленники должны договориться о комплексе проверенных генетических частей и наиболее эффективных стратегий их сборки.

Для того, чтобы получить искусственный продукт, синтетические биологи подбирают части ДНК с помощью компьютерной программы и изготавливают их с помощью специализированных инструментов. Далее такие части могут быть встроены в ДНК микроорганизмов и клеток, чтобы их перепрограммировать.

Благодаря резкому падению стоимости секвенирования ДНК в настоящее время существует обширная коллекция генетических данных, которую можно сортировать для получения нужных генов. "Биология дала нам эту огромную, потрясающую библиотеку данных, из которой есть, что выбрать”, - говорит Кристофер Фогт, синтетический биолог из Массачусетского технологического института (MIT) в Кембридже. Одна из ведущих баз данных, Американский Национальный центр биотехнологической информации GenBank, содержит более 190 миллионов последовательностей ДНК, полученных примерно из 100.000 организмов.

Некоторые из наиболее широко используемых отрезков ДНК кодируют ферменты - белки, которые необходимы для производства. К примеру, для того чтобы превратить глюкозу в гидрокодон, команда Смолки взяла 23 фермент-кодирующих генов из различных видов клеток и поместила их в геном дрожжей.

Другими зачастую используемыми в палитре генетического дизайнера отрезками являются промоторы - участки ДНК, которые регулируют активность соседних генов и экспрессируют их. Когда белки, называемые факторами транскрипции, связываются с промотором, начинается процесс транскрипции гена. Но для применения в некоторых областях синтетической биологии промоторы действуют слишком медленно. "Мы пытаемся производить вещи, которые работают быстро, в масштабах миллисекунд", - говорит биолог Памела Сильвер из Гарвардской медицинской школы в Бостоне, штата Массачусетс. Поэтому учёные исследуют альтернативные механизмы, которые дают возможность необходимого контроля экспрессии генов непосредственно с помощью сигналов из окружающей среды, таких как токсины или антибиотики.

Имея в своем распоряжении множество синтезированных отрезков ДНК, биологи могут реализовать свои творческие способности. Фогт с энтузиазмом рассказывает об этих возможностях: "Плюс биологии в том, что существует множество способов реализации одной и той же задачи - и, как инженер, вы можете выбрать наилегчайший для проектирования”. Но генетические отрезки должны работать последовательно, если нужно реализовать цели создания промышленных процессов. "Одной из ключевых проблем биологии в целом является отсутствие воспроизводимости, - говорит Ричард Китни, председатель Института систем и Синтетической биологии Лондонского Имперского колледжа, - в синтетической биологии это совершенно неприемлемо - если вы собираетесь заниматься промышленным производством, воспроизводимость должна присутствовать".

Многие исследователи собирают свои открытия в общих хранилищах, таких как Реестр стандартных биологических частей или Инвентаризатор компонуемых элементов. Но эти отрезки ДНК зачастую плохо охарактеризованы, или же не хватает важной информации об их экспериментальной проверке. "Единственный контроль качества - человек, отвечающий за хранение информации”, - рассказывает Фогт.

В марте 2015 года Американский Национальный институт стандартов и технологий (NIST) запустил Консорциум стандартов синтетической биологии с целью упорядочения проектирования, документации и комплектации элементов, используемых в синтетической биологии, среди академических и промышленных учреждений. В Соединенном Королевстве Китни координирует аналогичные усилия, целью которых является расширение стандарта обмена медицинской информацией DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine - Цифровая Визуализация и Коммуникации в Медицине) за счет включения этих элементов. Параллельно с этим, международная команда разработала SBOL (Synthetic Biology Open Language - Язык Синтетической Биологии открытого доступа), чтобы предоставить исследователям стандартизированный словарь для описания генетических отрезков и схем.

Источник: журнал Nature

Программное обеспечение клеток

Благодаря большей автоматизации, стало проще и дешевле, чем когда-либо, создавать отрезки синтетической ДНК (см. "Гены на заказ: Производство ДНК ещё никогда не было настолько простым"). Но соединение этих частей с образованием генетических схем, которые могут слаженно работать, обеспечивая сложные, подобные вычислительным, процессы, по-прежнему является проблемой. "Каждый раз, когда вы физически соединяете ДНК, то создаете новую последовательность в этом интерфейсе - однако ДНК настолько информационно богата, что вы можете создать новый промотор или изменить начало РНК”, - объясняет Фогт.

Даже тщательно разработанные схемы могут выйти из строя и вызвать нежелательную экспрессию гена или интерференцию между генетическими элементами в биологической цепи - результаты, которые невозможно предусмотреть на компьютерных моделях. "Синергия очень значима в мире, где невозможно предсказать, что произойдет в наших системах на этапе их построения", - говорит Решма Шетти, соучредитель синтетико-биологической компании Ginkgo BioWorks в Бостоне, штате Массачусетс.

Эта неопределенность означает, что многие шаги в области инжиниринга синтетических систем должны быть проверены и оптимизированы. Инструменты программного обеспечения и робототехника ускоряют каждую часть этого процесса: от создания искусственной ДНК до вживления её в микроба. "Вы можете использовать высокую пропускную способность прототипирования, просто конструируя все варианты подряд и надеясь, что один из них “выстрелит”, - говорит Джей Кислинг, инженер биохимии в Университете Калифорнии, Беркли, пионер в этой области. Стремление к автоматизации привело ряд фирм и исследовательских центров синтетической биологии к установке «биоконвейеров», где на роботизированных сборочных линиях создают, тестируют и оптимизируют микробов в гораздо больших количествах, чем это возможно делать вручную.

Такие конвейеры вдохновляют синтобиологов приступить к амбициозным проектам. Например, Войта, соучредитель MIT-Broad Foundry, лоббирует сотрудничество со швейцарской фармацевтической компанией Novartis для производства огромного спектра молекул, которые продуцировались бы бактериями кишечника человека.

Другие учреждения, преследующие биоконвейерные модели - Имперский колледж Лондона со своей программой SynbiCITE и Национальный университет производства микросхем в области синтетической биологии Сингапура. Агентство по развитию исследовательских проектов Министерства Обороны США (DARPA) также вкладывает значительные средства в MIT-Broad, в том числе заключив с ними в октябре 2015 года пятилетний контракт на 32 млн долларов США.

Некоторые биологи по-прежнему скептически относятся к поветрию расширения и автоматизации, отдавая предпочтение теории управляемой стратегии. Но Китни, соучредитель SynbiCITE, считает автоматизацию неизбежным шагом в развитии синтетической биологии. "Вы можете быстро запустить целую серию экспериментов параллельно, чтобы увидеть, какая конфигурация сработает лучше всего", - говорит он.

Идеальный хозяин

Виды, которые обычно используются в качестве модельных организмов в лабораторных условиях, такие как пивные дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) и бактерии кишечной палочки, также были “принуждены к сотрудничеству” с синтетическими биологами. Многие прорывы в биосинтезе произошли при использовании этих организмов, например, в 2003 году Кислинг и его сотрудники из Amyris, компании из Эммервиля, штата Калифорния, в которой он является одним из сооснователей, перепрограммировали S.cerevisiae для изготовления противомалярийного лекарства артемизинина.

Но эти традиционные для исследователей лабораторные организмы не обязательно подходят для выращивания в промышленном масштабе. Охота за лучшими альтернативами привела учёных к поиску в неизученных сферах. "Всё больше и больше лабораторий используют в исследованиях неизвестные ранее микроорганизмы - и мне кажется, что засилье S.cerevisiae и кишечной палочки отошло на второй план", - говорит Фогт.

В некоторых случаях организмами выбора будут те, что смогут выдерживать жесткие условия производства, объясняет Кислинг. "Например, вы производите что-нибудь токсичное, но летучее, поэтому если у вас есть организм, который может производить это вещество при относительно высоких температурах, можно испарять его прямо в процессе выработки". Учёные также проверяют, можно ли использовать в качестве субстрата для микробов источники углерода, отличные от сахара, получая при этом продукты синтеза.

Синтетико-биотехнологическая компания Intrexon из Джермантауна, штата Мэриленд, работает с бактериями, которые питаются метаном, более дешевым и эффективным средством для получения продуктов на основе углерода, чем сахар.

На старте синтетической биологии, учёные имели BioBricks - набор в формате генных отрезков, разработанный Томасом Найтом из Массачусетского технологического института в Кембридже и предназначенный для модульной сборки. Концепция была привлекательна, но сборка таких коротких частей для производства длинных последовательностей оказалась трудоёмким и потенциально подверженным ошибкам процессом.

Теперь эта задача сильно упрощена, потому что новые машины для синтеза ДНК могут штамповать цепи из нескольких тысяч, а не сотен, пар базовых оснований, что сокращает количество ошибок, вносимых в процессе сборки. "Вы можете просто заказать множество предварительно разработанных конструкций, так что об их модульности не придется больше и думать" - говорит Памела Сильвер из Гарвардской медицинской школы в Бостоне, штат Массачусетс. Стоимость изготовления самих отрезков ДНК также резко сократилось - на целых 85% в период с 2009 по 2014 год - до точки, в которой научные группы и компании обычно начинают привлекать сторонние источники финансирования, например, специализированных провайдеров, таких как Twist Biosciences из Сан-Франциско, штат Калифорния, Gen9 из Кембриджа, штат Массачусетс, и SGI-DNA из Ла-Хойя, штат Калифорния.

Многие проекты еще требуют доработки, превышающей масштаб мгновенного изготовления, но эти более длинные фрагменты могут быть соединены с помощью быстрых и простых методов, не оставляющих после себя никаких следов. Тем не менее, Джей Кислинг из университета Калифорнии, Беркли, считает, что даже это скоро станет делом прошлого. "Мы придем к тому, что сможем просто и недорого синтезировать такую ДНК, которая будет нужна, будь в ней 10000 или миллион пар оснований".

Рой Кальтшмидт, лаборатория Беркли

Модифицированные клетки в медицине

Когда дело доходит до медицинского применения, синтобиологи используют клетки млекопитающих, а не микробов. Такие модифицированные клетки могут производить лекарства в ответ на болезнь или брать на себя определенные физиологические задачи у людей с нарушениями обмена веществ, такими, как диабет. Но инжиниринг клеток млекопитающих провоцирует новые проблемы. "Все инструменты, которые у нас есть для дрожжей, просто не существуют для клеток млекопитающих”, - рассказывает Смолки. "У нас нет такого количества промоторов, инструментов для регуляции экспрессии генов или модификации белка”.

Самые простые культивируемые клетки - опухолевидные, иммортализованные ростки, которые являются по своей сути «дефектными» и, следовательно, нерепрезентативными для здоровых тканей. С другой стороны, первично полученные тканевые клетки трудно культивировать и манипулировать ими, а различия между их типами аннулируют усилия по созданию наборов инструментальных средств, которые могут быть применены для любой ткани. "Средство, работающее в клетке почки, не обязательно будет работать в легких или печени”, - говорит Фассенегер. Чтобы обойти эту проблему, команда ETH разработала “протезные генетические схемы”, вводящиеся в клетки-хозяева, которые могут быть имплантированы в месте заболевания.

Редактирование генома может также представлять проблемы. Даже "умные" инструменты для этого - такие, как CRISPR-Сas9, система введения целевых модификаций на конкретных участках ДНК - могут привести к непредсказуемым результатам. "Мы не знаем, достаточно ли в клетках человека локусов, в которые можно вмешаться, не нанеся вреда”, - объясняет Фассенегер. Его команда исследует, возможно ли избежать этой неопределенности путём введения генных сетей, встроенных в синтезированные петли ДНК, известные как плазмиды, а не интегрированных непосредственно в хромосомы. В качестве дополнительной меры предосторожности в его экспериментах на мышах, как правило, используются сконструированные клетки, заключенные в имплантируемые капсулы, а не изменения тканей животного.

Другие учёные хотят избавиться от клетки в целом. Джьюетт изучает бесклеточные системы, в которых бактериальные экстракты очищаются для извлечения только "полезных" в клеточной инженерии частей. "Вы получаете все ферменты, необходимые для производства энергии, регенерации кофактора или же синтеза белка, - рассказывает Джьюетт, - это дает вам беспрецедентную свободу непосредственно манипулировать условиями реакции”. Такой подход позволяет исследователям установить химические условия, которые обеспечивали бы максимальную производительность труда на производстве, не заботясь о сохранении здоровья клеток. Команда Джьюетт показала, что при таком подходе можно эффективно и в большом количестве производить полезные с медицинской точки зрения белки, такие как эритропоэтин - гормон, стимулирующий выработку красных кровяных телец. "Этот метод не заменит существующих технологий, но окажется хорошим подспорьем”, - говорит он.

Данная сфера исследования всё ещё находится в зачаточном состоянии - по факту, самые первые демонстрации сконструированных генетических схем произошли только в начале 2000 года - и может оказаться устрашающе сложной. Тем не менее, всё большее число учёных, воспитанных на традиционной молекулярной биологии, стремятся попробовать себя в генетическом редизайне. Синтобиолог Рон Вайс преподает в MIT онлайн-курс по этой дисциплине, что доказывает её популярность. "Послушать его зарегистрировалось более 14000 человек”, - говорит он.

Результат работы каждого, кто занят в этой сфере исследований, может оказаться непредсказуемо огромным. "Я занимаюсь этим потому, что для биологии нет никаких границ, - говорит Шетти, - это всего лишь вопрос технологий, дошедших до точки, где открываются новые горизонты”.

Оригинал

Перевод: Даня Ряскина

Изображения: Антон Осипенко

Редакция: Николай Лисицкий, Deepest Depths