Эпителиально-мезенхимальная пластичность: центральный регулятор опухолевой прогрессии

Xin Ye and Robert A. Weinberg Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) – основной фактор, обуславливающий злокачественность опухолей. Более того, недавно была открыта связь между процессами ЭМП и приобретением клетками стволовых свойств. Это позволяет сделать вывод о том, что ЭМП является основным механизмом, приводящим к появлению опухолевых стволовых клеток (ОСК), т.е. той субпопуляции опухолевых клеток, которые обуславливают инициацию и развитие заболевания. В этом обзоре мы поговорим о доказательствах важнейшей роли ЭМП в опухолевой прогрессии, а также попытаемся объяснить связь ЭМП с приобретением клетками стволовых свойств. Мы предполагаем, что эпителиально-мезенхимальная пластичность контролируется различными вариантами основной программы ЭМП, и очень важно разобраться в этих программах и в молекулярных механизмах, лежащих в их основе. Программа эпителиально-мезенхимального перехода – естественный процесс трансдифференцировки, который обуславливает эпителиально-мезенхимальную пластичность эпителиальных клеток и способен направить развитие эпителиальных клеток в сторону мезенхимальных. Активация этой программы приводит к тому, что нормальные и опухолевые эпителиальные клетки заселяют компартменты, характерные для стволовых клеток. Программа ЭМП запускается в ответ на различные синергические сигналы микроокружения как при нормальном развитии организма, так и в процессе развития опухоли. Эпителиально-мезенхимальная пластичность критична для опухолевой прогрессии и метастазирования. Ингибирование процессов ЭМП может быть новым терапевтическим подходом к лечению рака.

ЭМП ЯВЛЯЕТСЯ ЕСТЕСТВЕННОЙ ПРОГРАММОЙ ТРАНСДИФФЕРЕНЦИРОВКИ

В течение последнего десятилетия достигнуты огромные успехи в репрограммировании терминально дифференцированных клеток нормальных тканей в плюрипотентные стволовые клетки. Это привело к возникновению предположения, что практически всегда возможно осуществить дедифференцировку или же трансдифференцировку при условии введения необходимых эктопически экспрессированных транскрипционных факторов в зрелые клетки. Успехи в этих экспериментах по перепрограммированию клеток подняли очень важный вопрос: какие из наблюдаемых нами при этом изменений действительно являются «естественными» (встречающимися в природе), а какие «искусственными» (невозможными в природе при естественных условиях и возникающими при экспериментальном усилении эктопической экспресии генов)? Первой открытой естественной программой трансдифференцировки стала программа эпителиально-мезенхимального перехода, которая обеспечивает приобретение эпителиальными клетками некоторых мезенхимальных свойств и потерю некоторых эпителиальных. При этом существует и обратный механизм перехода – мезенхимально-эпителиальный. Данные, полученные в течение последних двух десятилетий, показали, что процессы ЭМП активируются во время нормального развития тканей и органов и обеспечивают взаимопревращения клеток разных типов, необходимые для формирования сложных тканей и органов животных. Эта клеточная биологическая программа управляется рядом транскрипционных факторов (ЭМП-ТФ), таких как факторы семейств Snail, Twist и Zeb-2. Еще два аспекта ЭМП заслуживают пристального внимания. Во-первых, в некоторых эпителиальных тканях явление ЭМП, по-видимому, связано с присутствием клеток, подобных стволовым. Во-вторых, опухолевые клетки могут видоизменять программу ЭМП, тем самым приобретая клеточные свойства, повышающие их злокачественность. Эти особенности программы ЭМП выявили ранее неизвестную связь онтогенеза и опухолевого патогенеза.

ПРОГРАММА ЭМП И ЭПИТЕЛИАЛЬНО-МЕЗЕНХИМАЛЬНАЯ ПЛАСТИЧНОСТЬ

ЭМП-программа, как следует из ее названия, регулирует изменения состояния клеток с более эпителиального на более мезенхимальное. В случае полного прохождения этой программы эпителиальная клетка становится мезенхимальной. Крайние степени эпителиальной и мезенхимальной дифференцировки имеют определенные отличия, приведенные в таблице 1. Так, можно отметить ключевые свойства эпителиальных клеток: полигональную форму в монослое культуры, поляризованность клеток по апикально-базальной оси и плотное соединение между соседними клетками адгезионными и плотными контактами; in vivo эти контакты обеспечивают структурную целостность слоев эпителиальных клеток. Напротив, мезенхимальные клетки имеют веретенообразную форму без признаков апикально-базальной полярности и слабо соединены с окружающим матриксом через фокальные контакты. Эти особенности мезенхимальных клеток позволяют объяснить их повышенную способность к миграции и инвазии, по сравнению с эпителиальными клетками.  

Таблица 1. Отличия эпителиальных и мезенхимальных клеток
Свойство	Эпителиальные клетки	Мезенхимальные клетки
Морфология в 2D-культуре	Полигональные	Веретенообразные, вытянутые
Поляризованность	Апикально-базальная	Передне-задняя
Подвижность	Нет	Подвижны и инвазивны
Цитоскелет	Экспрессия цитокератинов	Экспрессия виментина
Клетка-клеточные соединения	Формируют адгезионные и плотные контакты с соседними эпителиальными клетками	Не могут формировать адгезионные и плотные контакты; связываются с окружающим внеклеточным матриксом посредством фокальных контактов

  Принципиальные различия между эпителиальными и мезенхимальными клетками обусловлены различиями в соответствующих транскрипционных программах, которые контролируют, помимо прочего, экспрессию ключевых структурных белков, участвующих в поддержании цитоскелета и в образовании межклеточных контактов. Эпителиальные клетки синтезируют различные типы цитокератина, из которого построены их промежуточные филаменты, в то время как мезенхимальные клетки экспрессируют виментин, выполняющий ту же самую функцию. Экспрессия молекул межклеточной адгезии и комплексов поляризации клетки в мезенхимальных клетках, как правило, подавлена. Характерной чертой эпителиально-мезенхимального перехода является замена Е-кадгерина на N-кадгерин, что приводит к ослаблению контактов между клетками. Программа ЭМП активизируется в эпителиальных клетках с необычайно высокой скоростью в ответ на ряд физиологических сигналов, как исходящих из стромы, так и автономных. Например, при гаструляции программа ЭМП инициируется в эпителиальных клетках эпибласта, преобразуя их в мезенхимальные клетки мезодермы под воздействием ряда сигналов – факторов роста фибробластов (FGFs) и сигнального пути Wnt. Подобным образом в тканях взрослого организма программа ЭМП быстро активируется при ранениях, обеспечивая быстрое закрытие раны и восстановление эпителиальных барьеров, необходимых для защиты организма от внешних повреждающих факторов. Такое быстрое взаимопревращение эпителиальных и мезенхимальных клеток предполагает их большую чувствительность к сигналам, вызывающим ЭМП. Кроме того, эпителиальное и мезенхимальное состояния метастабильны, и для долговременного нахождения клетки в одном из них требуется работа сложных молекулярных и клеточных механизмов. Восприятие программы эпителиально-мезенхимального перехода как дискретного переключателя с двумя положениями «эпителиальная клетка» - «мезенхимальная клетка» не отражает работы этой программы, так как при ЭМП в новой «мезенхимальной клетке» остаются ключевые эпителиальные маркеры . Тем не менее, приобретение даже небольшого числа мезенхимальных свойств значительно меняет биологию клетки.

ЭМП И НОРМАЛЬНЫЕ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ

Работы последних пяти лет в области ЭМП сходятся в выводах о том, что если эпителиальная клетка хотя бы частично подвергается ЭМП, то она приобретает черты эпителиальной стволовой клетки. По меньшей мере, это оказалось верным в случае клеток молочной железы, как нормальных так и опухолевых.. Учитывая биологическое подобие всех эпителиальных клеток, можно экстраполировать этот вывод и на все эпителиальные ткани. Стволовой характер эпителиальных клеток можно продемонстрировать на основании их способности воссоздавать ткань, из которой они были получены, после их трансплантации в подходящее микроокружение. Например, стволовость нормальных эпителиальных клеток молочной железы может быть оценена по их способности имплантироваться в структуру, образованную жировыми клетками молочной железы (т.е. ту структуру, из которой хирургически удалили древо млечных протоков у молодой самки мыши). После имплантации этих клеток через 6-8 недель образовались структуры «дерева» с протоками, неотличимыми от тех, которые образуются при нормальном морфогенезе молочной железы. Такой успех в формировании молочной железы дает возможность ввести строгий тест на стволовые качества, который, несомненно, подтверждает то, что подвергшиеся ЭМП эпителиальные клетки обладают свойствами стволовых клеток и могут воссоздать целый орган. В другом случае сообщалось, что в результате индукции ЭМП совместным воздействием кратко экспрессируемых ЭМП-ТФ Slug и SRY-Box9 (Sox9, SRY - область, определяющая пол в Y-хромосоме) в популяции нормальных мышиных эпителиальных клеток молочной железы количество стволовых клеток молочной железы увеличивалось в два раза. Дополнительно было показано, что ЭМП-ТФ Slug в норме экспрессируется в базальных и/или аблюминальных слоях млечных протоков мышей и человека: там же, где, как предполагается, располагаются стволовые клетки молочной железы. Анализ с методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией, проведенный на обогащенной с помощью сортинга на проточном цитометре популяции стволовых клеток молочной железы, показал, что располагающиеся в нормальных молочных протоках стволовые клетки экспрессируют транскрипционный фактор Slug (характерный для ЭМП) на уровне на два порядка выше, чем популяция дифференцированных эпителиальных клеток люминального слоя.. Эти наблюдения подтверждают, что по меньшей мере один компонент программы ЭМП может проявляться и в здоровых тканях без патологии, например, при процессах заживления или неоплазии. Найти рациональное биологическое объяснение связи между ЭМП и стволовыми качествами нелегко. Судя по всему, эта клеточная реакция является не недавним изобретением млекопитающих, а возникла еще во времена зарождения царства животных (metazoa). Шаг в сторону понимания этого процесса можно сделать, рассмотрев то, как происходит заживление ран в эпителиальных тканях. Закрытие раны включает в себя миграцию эпителиальных клеток в место дефекта, их пролиферацию и, в самом конце, сборку межклеточных соединений, таких как адгезионные контакты. Считается, что полностью эпителиальные клетки мало подвижны по сравнению с их мезенхимальными аналогами - это говорит о том, что эпителиальные клетки по краям раневого дефекта по крайней мере частично активируют программу ЭМП. Действительно, это было подтверждено на экспериментальной модели рубца в монослое кератиноцитов: по краю нанесенного разрыва эпителиальные клетки экспрессировали характерный для ЭМП транскрипционный фактор Slug. В экспериментах на мышиной модели in vivo также было показано, что в кератиноцитах, локализованных по краям кожной раны, экспрессия Slug повышена. В то же время кератиноциты, полученные от нокаутных по гену Slug мышей, оказались неспособны к закрытию раневого дефекта. Эти исследования подтверждают роль временной активации ЭМП в процессах заживления эпителиальных дефектов. В то же время этим клеткам необходимо ускорить собственную пролиферацию для быстрого закрытия дефекта. Это может потребовать присутствия стволовых клеток, которые образуются путем активации программ ЭМП. Благодаря эпителиально-мезенхимальной пластичности после миграции в область раны и быстрого увеличения популяции эпителиальные клетки, подвергшиеся ЭМП, могут пройти через МЭП для восстановления эпителиального слоя клеток и приобретения исходного эпителиального морфотипа; вероятно, обратный переход сопровождается уменьшением размеров популяции стволовых клеток. На данном этапе все это лишь неточные предположения, но рациональное объяснение вроде этого поможет обнаружить ранее незамеченную связь между ЭМП и свойствами эпителиальных стволовых клеток.

ЭМП И КАНЦЕРОГЕНЕЗ

Почти 80% всех злокачественных опухолей человека происходят из эпителиальных тканей. Эти опухоли представлены разнообразными нозологическими формами: рак легких, толстой кишки, яичников, молочной железы, поджелудочной железы, предстательной железы, печени, мочевого пузыря, почки. На начальных стадиях клетки этих опухолей продолжают синтезировать цитокератины и E-кадгерин, что подтверждает их эпителиальное происхождение. Помимо этого, опухолевые клетки в ранних опухолях продолжают проявлять биологические свойства, характерные для эпителиальных клеток: они неподвижны и формируют протяженные слои клеток. Эти клетки резко отличаются от тех, которые появляются в дальнейшем в результате так называемой «опухолевой прогрессии». Клетки высокоагрессивных первичных опухолей приобретают свойства мезенхимальных клеток, что проявляется в их способности к миграции, инвазии и, как следствие, к распространению метастазированием. Эти изменения можно объяснить с той позиции, что в результате опухолевой прогрессии в данных клетках активизировались программы ЭМП. Если рассмотреть рак молочной железы как пример, то мы увидим, что приобретение клетками мезенхимальных свойств ассоциируется с более агрессивными подтипами заболевания и опухолевой прогрессией. Еще лучше связь ЭМП и опухолевой злокачественности демонстрирует ряд экспериментов по утрате или приобретению функций на ксенотрансплантатных моделях опухолей. В экспериментах на клеточных линиях опухолевых клеток молочной железы человека и животных удаление ЭМП-ТФ (Twist, Snail и Zeb1 (гомеобокс 1, связывающий E-бокс цинкового пальца)) значительно подавило метастатическое распространение как из мест первичной локализации опухоли (например, из стромальной жировой ткани молочной железы), так и после введения опухолевых клеток в венозное русло (например, в хвостовую вену). И наоборот, эктопическая активация ЭМП с помощью транскрипционных факторов приводит к усилению процессов метастазирования введенных опухолевых клеток Помимо облегчения процессов метастазирования, программа ЭМП играет важную роль в возникновении лекарственной резистентности у опухолевых клеток и рецидивов заболевания у больных раком молочной железы. Так, на мышиной модели Her2-индуцированных опухолей ЭМП-ТФ Snail способен спонтанно активироваться в очагах рецидива опухоли и направлять эти новые опухолевые клетки в сторону мезенхимального развития, что показывает еще один пример связи ЭМП и рецидива заболевания. Связь между программой ЭМП и усилением туморогенеза была продемонстрирована на разнообразных клеточных линиях человеческих опухолей. Имеются данные, что ингибирование эпителиально-мезенхимального перехода с помощью блокирования ЭМП-ТФ Zeb1 подавляет переход опухолевых клеток из состояния низкой онкогенности к более высокой. Интересно, что ряд недавних исследований показал наличие связи между программой ЭМП и приобретением некоторыми опухолями способности подавлять иммунный ответ. В случае меланомы экспрессия ЭМП-ТФ Snail одновременно ингибирует дифференцировку цитотоксических Т-лимфоцитов и индуцирует образование иммуносупрессивных регуляторных Т-лимфоцитов, причем второй эффект опосредован продукцией тромбоспондина. При раке молочной железы активация программы ЭМП в опухолевых клетках приводит к увеличению их резистентности к лизису цитотоксическими Т-лимфоцитами, что частично связано с индукцией аутофагии. В клетках рака легкого активация Zeb1 связана с экспрессией лиганда программируемой гибели-1 (Programmed death-ligand 1 - PD-L1) – иммуносупрессивной молекулы, блокирующей деятельность инфильтрирующих опухоль лимфоцитов. Учитывая множественные эффекты активации программы ЭМП на развитие рака и растущее количество данных об ассоциации ЭМП с разными типами агрессивных раковых клеток, можно резонно предположить, что фактически все раковые опухоли начинают проявлять злокачественность в результате активации ЭМП в опухолевых клетках. Однако данное утверждение может и должно быть рассмотрено критически, так как многие клинические патоморфологи оспаривают само существование программы ЭМП или ее роль в формировании низкодифференцированной карциномы. Значительная часть их недовольства, видимо, происходит из-за технической стороны вопроса. С помощью используемых маркеров очень сложно (а иногда и невозможно) отличить на препарате ткани подвергшиеся ЭМП опухолевые клетки от прилежащих к ним клеток опухолевой стромы: рекрутированных из нормальных тканей фибробластов и миофибробластов, которые в норме экспрессируют маркеры ЭМП. В виду того, что клетки карциномы часто зачастую подвергаются частичному ЭМП, достоверным доказательством участия этой программы в развитии опухоли может служить обнаружение клеток, которые экспрессируют приобретенные мезенхимальные черты одновременно с определенными “остаточными” эпителиальными маркерами, унаследованными от своих полностью эпителиальных предшественников. Действительно, недавние исследования образцов рака молочной железы человека методом гибридизации in situ одновременно на эпителиальные и мезенхимальные маркеры позволили обнаружить клетки опухоли, обладающие как эпителиальными, так и мезенхимальными маркерами при инвазивном раке молочной железы любого подтипа. Кроме того, значительная часть циркулирующих опухолевых клеток, выделенных из периферической крови больных раком молочной железы или раком простаты, также экспрессировали и мезенхимальные и эпителиальные маркеры. Широкое участие программы ЭМП в патогенезе карцином поднимает вопрос о ее возможной роли в развитии некарциноматозных опухолей, встречающихся в клинике. Нейроэктодермальные опухоли, такие как глиомы и глиобластомы, часто имеют мезенхимальные маркеры на своих клетках, включая различные транскрипционные факторы ЭМП, что может свидетельствовать о частичном прохождении ими ЭМП. С точки зрения биологии развития, данное обстоятельство можно объяснить тем, что источником развития этих опухолей является нейроэктодерма - примитивный эпителий. Однако прогрессирование двух других крупных классов опухолей (гемобластозов и мезенхимальных опухолей), по-видимому, не связано с активацией программы ЭМП. Действительно, по меньшей мере в случае сарком клетки (вероятно, клетки похожие на фибробласты и мезенхимальные стволовые клетки (МСК)) постоянно продуцируют ряд транскрипционных факторов ЭМП, по видимому, для поддержания своего мезенхимального состояния. Можно предположить, что нормальные клетки, давшие начало саркоме, прошли через программу ЭМП на ранних стадиях онтогенеза, задолго до развития опухоли. Действительно, примитивные клетки соединительной ткани (т.е. клетки, похожие на МСК) могут быть созданы экспериментально при инициации полного прохождения эпителиальными клетками программы ЭМП. При этом полностью исчезают признаки эпителиального происхождения, которые замещаются на мехенхимальные признаки.