Искусственные органы: дорогая, я уменьшил легкие!
В 1537 году швейцарско-немецкий ученый Парацельс придумал метод создания миниатюрного человека, который «будет выглядеть примерно как человек, но при этом оставаться прозрачным, без тела». Так или иначе, алгоритм создания того, кого Парацельс окрестил гомункулюсом, представлял собой малопривлекательную смесь алхимии и межвидового скрещивания.
Сейчас ученые пробуют создать другую концепцию гомункулюса, но на этот раз они используют продвинутые биоматериалы, инженерные подходы и физиологические идеи для того, чтобы заставлять клетки превращаться в упрощенные, но рабочие миниатюрные версии сердец, легких и других человеческих органов. Размещенные на микросхемообразные устройства, многие из этих органов могут быть подключены к искусственной кровеносной системе для получения так называемых устройств «человек на чипе», в размерах обычно не превышающих пары сантиметров.
Этот прорыв означает «очеловечивание» биомедицинских исследований. Целые поколения ученых до этого работали, в основном, с клетками, которые росли одиночными слоями на плоских искусственных поверхностях – обычно твердых пластмассах, таких как поликарбонат, которые не имели ничего общего с живым материалом – в емкостях с синтетической средой из клеточной культуры содержится коктейль лишь из наиболее важных ионов, нутриентов и факторов роста.
Другой подход
В отличие от предыдущих изысканий, при создании биоинженерного гомункулюса ученые – такие, как Дональд Ингбер, исполнительный директор института биологической инженерии Уисса при Гарвардском университете (Бостон, Массачусетс), и его коллеги задались целью воссоздать физические структуры, силы и взаимодействия, которые влияют на клетки внутри живых органов и тканей. Появившиеся в результате этого экспериментальные модели оказались более реалистичными, чем стандартные клеточные культуры, и более удобными для исследований, чем лабораторные животные, при этом оставаясь настолько маленькими, что могли разместиться под микроскопом. Эти модели обещали избавление от множества ложных путей и тупиков, которые подстерегали исследователя в проблемном и затратном мире открытия и испытания лекарств (см. «Концептуальное представление органов человека на чипе»).
Макет нейрососудистого «блока-на-чипе», разработанного в университете Вандербилт. Frank E. Block, III, Virginia Pensabene, Dmitry Markov & John P. Wikswo.
Силы природы
Сегодняшние системы разработки препаратов, требующие множества испытаний на животных, приводят к проблемам из-за того, что люди, с точки зрения метаболизма химических элементов, сильно отличаются от грызунов и других лабораторных животных. Например, троглитазон был быстро внедрен в практику в середине 1990-х для лечения диабета в США, Японии и Великобритании, но в 2000 году был отозван из-за своей гепатотоксичности – его использование привело к возникнованию летального исхода у 63 пациентов. Эта особенность препарата не была, однако, выявлена на проводившихся ранее экспериментах на крысах.
Настоящие ткани человека можно использовать как дополнение к испытаниям на животных, но тканевые срезы короткоживущи, а получать их тяжело. Ученые также могут извлекать первичные клетки, такие, как гепатоциты печени, из подходящих человеческих органов, но после выращивания на ровном пластике они значительно утрачивают свою функциональную идентичность. “Намного более сложной задачей остается воссоздание в культуре комплексного
взаимодействия между множеством типов клеток, которые и дают органу возможность функционировать», – сказал Джон Уиксво, физик и биомедицинский инженер университета в Нэшвилле, Теннесси. «Гетерогенность – это важно», - отметил он.
Достижения на поприще биоматериалов теперь дают возможность ученым повторять организацию ткани, используя знания о том, как клетки в естественной среде распределяются внутри гнезд белковых волокон, известных также как внеклеточный матрикс. Эти волокна не только образуют физический каркас (скаффолд), но еще взаимодействуют с рецепторами на поверхности клеток, чтобы посылать важные сигналы, регулирующие их рост и развитие. Естественную структуру внеклеточного матрикса воссоздать сложно, но оно того стоит: даже обычная пластиковая основа, покрытая белками внеклеточного матрикса, может создать выращенным клеткам удобную поверхность для того, чтобы закрепиться на ней, а также помочь им восстановить способность к самоорганизации.
«По сути, мы можем создать миниатюрную человеческую печень на блюдечке»
Биоинженерная команда Сангиты Бхатии из MIT разработала значительно улучшенную модель культуры клеток печени, размещая человеческие гепатоциты на островки внеклеточного матричного белка коллагена. Далее они были окружены клетками других типов, таких, как фибробласты кожи. Взаимодействуя с островками гепатоцитов, они помогают им поддерживать свою специфическую для печени метаболическую функцию и генетическую активность, которые в иных случаях были бы утеряны. «В принципе, мы можем создать миниатюрную человеческую печень на блюдечке», - говорит Бхатия. Для ее команды это открывает колоссальные возможности по изучению болезней печени, вызванных специфическими человеческими патогенами, которые значительно изменяются при моделировании на животных, такие как гепатит и малярия.
Эти системы клеточных культур все еще отстают от настоящих органов, которые состоят из множества слоев, организованных в трех измерениях – а это свойство очень важно для клеток и их взаимоотношений внутри ткани. Поэтому ученые пытаются сделать системы более естественными, наделяя их большим объемом специализированных материалов, а процесс клеточной печати направляя как раз на создание целых пластов из организованных, выращенных клеток. Множество основанных на воде полимеров гидрогелей можно заставить измениться жидкого до твердого агрегатного состояния, регулируя pH или используя лазеры, которые ученые применяют для воздействия на определенные клеточные популяции внутри твердых матриц. Бхатия использует технологию inVERT для создания трехмерных (3D) слоев из заключенных в гидрогель клеток, на которые накладывают следующий слой, последовательно собирая различные типы клеток в высокоорганизованные отлаженные тканевые сообщества на манер того, как гравер наносит слой за слоем краску с помощью трафарета, чтобы в конечном итоге получить цельную картину.
Эти трехмерные системы с физиологической точки зрения являются более точными, чем культуры, выросшие в чашке Петри, но они по-прежнему не могут воссоздать множество основных функций органов из-за своей статичности. Внутри динамической среды нашего тела физические силы создают давление и напряжение на чувствительные к окружению белки поверхности клетки. В
процессе, называемом механотрансдукцией, эти физические силы создают биохимические сигналы, которые являются пусковым механизмом важных изменений в организации и взаимоотношениях между клетками. Наиболее универсальной из таких сил является сила трения, которую создает кровоток; эндотелиальные клетки, выстилающие кровеносные сосуды, формируют хаотичное месиво в статической культуре, но реорганизуются и выстраиваются по порядку, если помещены в направленный поток жидкости. Долгое время ученые использовали громоздкие и дорогостоящие системы биореакторов для воссоздания этого тока жидкости. Альтернативой им служат методы и устройства, основанные на кремниевых чипах, которые адаптируются для создания уменьшенных биореакторов, базирующихся на микрофлюидных основанных на стекле или полимерах устройствах с небольшими насосами, клапанами и каналами, направляющими ток жидкости согласно направлению перемещения электронов внутри чипа.
Системы «орган-на-чипе» могут также управлять другими биологическими силами, необходимым в работе таким ученым, как Ингбер. Для имитации среды легких внутри устройства, работающего по принципу микрофлюидики, команда Ингбера вырастила эпителиальные клетки, взятые из человеческих альвеол, и эндотелиальные клетки кровеносных сосудов, которые были размещены на другой стороне богатой порами полимерной мембраны. Клетки были одна за другой подвергнуты воздействию воздуха, а те, что были на другой стороне мембраны – потоку жидкости. Периодически создавая вакуум в полостях устройства, ученые могут заставлять эти расположенные на мембранах клетки подвергаться растяжению и расслаблению, имитируя ритмические движения во время дыхания. Это искусственное легкое реагирует подобно человеческому в случае воздействия на него каких-либо факторов, таких как бактерии или вызывающих воспаление наночастицы, поэтому данная система была использована командой Ингбера для изучения механизмов накопления жидкости внутри легочной ткани при отеке легких. Выборочно применяя действие той или иной физической силы на подобные модели, его группа также попыталась воссоздать другие функции органов, используя небольшое количество клеток. «Все, что мы делаем – меняем физическую микросреду и наблюдаем взаимодействие, которое до нас никто не видел», – сообщил он. – «Мы видим похожие вещи в моделях кишечника с перистальтикой, модели почки с током жидкости и удивляемся их достоверности и надежности».
Организующееся сообщество
Исследователи заявляют, что наиболее ожидаемой от этой технологии является возможность того, что системы «орган-на-чипе» смогут интегрироваться друг с другом для упрощенного моделирования всего тела. Это может означать существенную выгоду при испытании лекарств, когда зачастую вся полнота эффектов вещества не проявляется в полной мере, пока оно не образует активных метаболитов, пройдя через почки или печень.
Майкл Шулер, биомедицинский инженер Корнелльского университета в Итаке (Нью Йорк), был одним из пионеров в этой области. Команда Шулера анализировала токсичность различных химикатов, используя, как это назвал Шулер, микроразмерный клеточно-культурный аналоговый прибор (microscale cell-culture analogue device), который постоянно прокачивал клеточно-культурную среду между тканевыми блоками, представляющими различные системы органов млекопитающих. В своем первом тесте команда использовала бытовой химикат нафталин (основной ингредиент шариков от моли) в мультиорганном устройстве, которое содержало легочную, печеночную и жировую ткань. Исследование показало, как нафталин, метаболизируясь в печени, образовывал токсичные соединения, вызывающие повреждение и смерть клеток
легких, при том, что сам по себе нафталин относительно безвреден для этого органа. «Если мы убирали компонент печеночной ткани, то больше не наблюдали гибель клеток легочном блоке», – сказал Шулер. Другие мультиорганные системы впоследствии превращались из двумерных (2D) культур на пористой мембране в более сложные совокупности внутри 3D-гидрогеля и других матриц.
В Уисском институте Ингбер и коллеги занимаются подключением друг к другу созданных ими уменьшенных органов; к февралю 2014 года они уже прошли большой путь к построению автономных систем, которые могут содержать в себе до 10 таких органов и могут жить больше недели. Ингбер, Шулер и другие также показывают, что более простые мульти- или моноорганные конструкции могут существовать и месяц – этого срока как раз хватило бы для того, чтобы проанализировать токсичность, вызванную долговременным контактом с каким-либо веществом.
Я действительно полагаю, что каждый орган является своеобразным химическим реактором
Но подключение множества органов – это не так просто, как собирать биологическое Лего. Наибольшей сложностью является сопоставление размеров в этих системах in vitro, чтобы они совпадали с физиологией тела человека, например, объем жидкости in vitro должен быть пропорционален объему in vivo. Системы, основанные на микрофлюидике, которые пропускают малые части культуральной среды через узкие каналы, содержащие 3D-клеточные структуры, способны изображать процессы, происходящие в реальном теле, лучше, чем системы с большим объемом жидкости. Однако создаваться они должны с крайней скрупулезностью. «Если вы неправильно устанавливаете объемы, печень или почки внезапно окажутся в океане из культуральной среды и даже не будут подозревать о том, что существуют еще какие-либо органы», – говорит Уиксво. Относительный размер также имеет значение: создание миниатюрного человеческого «тела-на-чипе» не означает уменьшение каждого органа в 1000 раз. Размер органа определяется множеством факторов, такими как масса организма, площадь поверхности и объем жидкости. Для упрощения этой задачи многие ученые рассматривают увеличение размеров органа лишь до достижения некого функционального базиса, чтобы получить результат, достаточный с точки зрения физиологии, как в случае с симуляционной моделью легких, получающих необходимое количество кислорода при каждом вдохе, или модель печени, пропорционально метаболизирующей биомолекулы. «Я действительно полагаю, что каждый орган является своеобразным химическим реактором», – заявил Шулер.
Подбор материала для субстрата также является проблемой. Большая часть систем «орган-на-чипе» или «тело-на-чипе» собирается на основе полидиметилсилоксана: дешевого, нетоксичного полимера, который легко превратить в прототипы органов. Но полидиметилсилоксан обладает способностью абсорбировать небольшие молекулы, и, к несчастью, к ним относятся многие лекарства – именно поэтому сейчас идет поиск более подходящих полимеров. Одной из альтернатив является сборка разнообразных частей органов с использованием кровеносных сосудов, созданных с помощью биоинженерии. Такие сосуды будут выстилать полимерные каналы в этой системе. Осенью 2014 года Бхатия вместе с Кристофером Ченом из Бостонского университета в Массачусеттсе, Горданой Вуньяк-Новакович из университета Колумбии в Нью-Йорке и Карен Хирши из Йельской школы медицины в Нью-Хейвен (Коннектикут) разработали мультиорганную систему, которая содержала в себе части сердца и печени, соединенные живыми капиллярами. Уве Маркс из Берлинского технического университета заявил, что это добавит моделированию совершенно новый уровень реалистичности. «Клетки в этих сосудах также передают информацию между тканями», – говорит он. – «Система кровеносных сосудов – это нечто гораздо большее, чем просто обеспечение питания органов».
Однако по-прежнему остается неясным, что именно должно перекачиваться через эти сосуды; каждая ткань в нашем организме поддерживается одной и той же жидкостью – кровью, и до сих пор идет поиск ее суррогата, совместимого с различными культивируемыми типами клеток. "Мы можем, в конечном итоге, использовать одну и ту же жидкость во всех чипах, но локально дополнять каждую систему различными факторами роста," – говорит Бхатия. "Это подобие работы тела." Если легочной ткани требуются биомолекулы, негативно влияющие на печеночные или другие типы клеток, например, вполне возможно ограничить область их действия, аккумулировав молекулы в хранилище гидрогеля, который медленно высвобождает фактор непосредственно в легочный блок.
Просто, но не слишком
Ингбер подчеркивает, что его основной целью является отражение в модели функции, а не структуры. "Мы начинаем с простейших вариантов и смотрим, на что они способны», - говорит он. - "Если чего-то не хватает, мы добавляем это пошагово, и не сразу же в тот момент, когда вдруг поняли, что нам это необходимо."
Тем не менее, он также подчеркивает, что его группа преследует благородную цель построения модели человеческого тела с максимально возможной функциональностью, в партнерстве с коллегой из Уисса Кевином Паркером. У модели будет бьющееся сердце, перистальтирующий кишечник и дышащие легкие, а поддерживаться все будет с помощью автоматизированной системы. Она может быть более сложной, чем того требуется многим научно-исследовательским группам. Группа Уискво, напротив, ведет поиск более простых механизмов. "Лучшим способом использования этих систем," - говорит он, - «будет наличие небольших, дешевых гаджеты в руках любого биолога, который в них нуждается."
Многие лаборатории, ведущие исследования в данном направлении, создали спин-офф компании для разработки своих платформ; компания Маркс, например, является соучредителем берлинского TissUse с 2010 года. В настоящее время она предлагает два тканевых чипа для тестирования на наркотики и токсиканты. Ингбер и Шулер также создали стартапы. Параллельно, Национальный институт здравоохранения и обороны вместе с Агентством программ перспективных исследований вложили почти 150 млн долларов США в кросс-агентство, финансирующее развитие программы, объединяющей проекты «органа-» и «тела-на-чипе». Управление по контролю за продуктами питания и медикаментами США также принимает активное участие, а еще изучает, как эти системы могут вписаться в их регулирующие процессы.
Существует общее мнение, что, открывая истинное окно во внутреннюю работу организма, эти компактные, прозрачные системы «органов-на-чипе» могут испольсоваться для тестирования на наркотики. Можно включить датчики, которые отслеживают обмен веществ с использованием уровней глюкозы и рН, или точно измерить напряжение сокращающейся мышцы или поток крови в режиме реального времени. Это может, например, показать, есть ли у препарата потенциал, чтобы изменить частоту сердечных сокращений пациента или помешать функции печени. Уискво сотрудничает с химиком из Вандербильта Джоном Маклином, чтобы непосредственно интегрировать молекулярный анализ с использованием масс-спектрометрии, исчисляющейся тысячами биомолекул, в крошечные временные рамки по десять минут.
Моделированные органы даже могут быть извлечены для более тесного гистологического исследования, а затем их можно вернуть обратно, не нарушая эксперимента.
"Основная цель сейчас: узнать и понять вопросы, которые до сих пор не могли быть решены при помощи лабораторных животных, а также любого одиночного органа или культурального раствора одной ткани," - говорит Маркс. Пощадив миллиарды лабораторных животных, эти устройства могут также значительно упростить испытания на людях - например, оценивая доклинически лекарства-кандидаты, выявлять именно те, которые стоит тестировать в первой фазе эксперимента. "Вы можете проверить от 5 до 10 различных лекарств на чипе, прежде чем отправить одно из них, наиболее подходящее, в клинический эксперимент ", - говорит Уискво. - "Тогда, если что-то интересное - хорошее или плохое – произойдет во время фазы I, при помощи этих устройств вы сможете откатить события назад, чтобы выяснить, что происходит."
Уискво возлагает большие надежды на то, что биомедицинские исследования выиграют от эволюции культуральных баз от статических к динамическим, генерирующим устойчивые потоки физиологических данных. "Мы хотим, чтобы эти системы были достаточно надежны для работы в эксперименте, достаточно небольшими, чтобы вы могли разместить два десятка в одном инкубаторе, и достаточно дешевыми, чтобы выбросить после использования."
Автор: Майкл Эйзенштейн
Перевод: Сергей Ткачев
Редактор: Даня Ряскина
