Троянский конь легионелл. Перехват рибосом хозяина с помощью мимикрии тРНК
У бактерий Legionella pneumophila (тех самых, которые вызывают “болезнь легионеров”) обнаружен интересный механизм перехвата рибосом клетки-хозяина. Они синтезируют белок-эффектор SidI, который ингибирует реакцию элонгации трансляции, имитируя свои N-концом т-РНК, а с помощь C-концевого домена гликозилирует рибосому.
Микроорганизмы используют различные стратегии для захвата контроля над трансляцией хозяина. Обычно такое характерно для вирусов, но многие бактериальные патогены человека также могут разными способами захватывать механизм трансляции. Самым известным примером может служить дифтерийный токсин Corynebacterium diphtheriae, который ингибирует активность эукариотического фактора элонгации 2 (eEF2) посредством рибозилирования АДФ. Еще одна стратегия среди факультативных внутриклеточных паразитов, используемая многими бактериями — гликозилирование белков хозяина. L. pneumophila использует целый арсенал токсинов в цитоплазме своего хозяина, воздействуя на различные процессы и сигнальные пути. Несколько эффекторов Legionella останавливают глобальный синтез белка путем модификации факторов элонгации. Например, токсины семейства Lgt (Lgt1–3) ингибируют фактор элонгации хозяина 1A (eEF1A). Такие токсины, как SidI и SidL, также атакуют процесс элонгации трансляции. SidI обладает гликозилтрансферазной активностью, но его молекулярная мишень остается неизвестной. Изначально предполагалось, что SidI связывается с eEF1A и eEF1Bγ, однако эффект связывания мало коррелирует с его цитотоксичностью, что говорит о существовании других механизмов.
Subramanian и соавт. исследовали эти механизмы, изучая несколько активно продуцируемых токсинов Legionella, которые действуют как ингибиторы элонгации. Используя бесклеточную трансляцию in vitro, авторы определили SidI как наиболее сильный ингибитор синтеза белка. SidI взаимодействует со многими компонентами механизма трансляции, включая рибосомальные белки и белки трансляции. С-концевой сегмент SidI имеет гликозилтрансферазный центр и гликозилирует свои субстраты, используя ГТФ-маннозу. N-концевой домен SidI имеет L-образную структуру, очень похожую на молекулу тРНК. Все это в совокупности обеспечивает широкий спектр белков-мишеней.
Таким образом, SidI представляет собой мультидоменный белок с двумя различными функциями: N-концевой тРНК-имитирующей областью и С-концевой гликозилтрансферазы. Эти домены структурно независимы, но функционально взаимосвязаны и работают вместе, ингибируя синтез белка в клетках хозяина. Можно предположить, что тРНК-мимикрирующий домен SidI нацелен на рибосому своей гликозилтрансферазной активности путем маннозилирования ближайшего субстрата.
Такие димеры рибосом вызывают активацию ZAKα, за которой следует фосфорилирование p38 и последующая индукция ATF3. Активация ATF3 запускает риботоксический стресс в клетке, приводя к ее смерти и распространению бактерий.
Действительно, используя гликозилтрансферазы in vitro Subramanian и соавт. показали, что SidI маннозилирует по меньшей мере 25 рибосомальных белков, почти половина из которых была расположена вблизи центра декодирования. Известно, что рибосомальные белки подвергаются различным посттрансляционным модификациям, включая фосфорилирование, метилирование, ацетилирование, убиквитинирование и АДФ-рибозилирование. Физиологические последствия гликозилирования рибосом маннозой остаются фундаментальным вопросом.
Обнаружилось, что в результате действия токсина происходит сближение и “слипание” рибосом (ribosome collision) с образованием дисом (в смысле димеров рибосом). Nакже в клетках, инфицированных легионеллами, повышалась экспрессия ATF3 (активирующего транскрипционного фактора 3), являющегося признаком риботоксического стресса. Также в ответ на действие риботоксинов клетки обычно запускают интегрированный стрессовый ответ, в задачи которого входит остановка инициации трансляции, чтобы снять нагрузку на рибосомы. В случае с токсином легионелл SidI этой реакции не происходило, вероятно из-за чрезвычайно сильного риботоксичесого стресса и активации ATF3 транскрипционных программ, приводящих к гибели клеток.
Несмотря на глобальное ингибирование синтеза белка в присутствии SidI, трансляция ATF3 не страдала и даже повышалась. Вообще, приоритетная трансляция стресс-ассоциированных мРНК — обычная стратегия клеток, направленная на борьбу с неблагоприятными условиями. Аналогичным примером может служить ATF4, транскрипционный фактор интегрированного стрессового ответа; многие гены, связанные со стрессом, опираются на цис-регуляторные элементы, такие как короткие открытые рамки считывания (uORF) для контроля (как правило, подавления) трансляции основных кодирующих областей. Действительно, 5′ нетранслируемая область мРНК ATF3 содержит перекрывающуюся uORF, которая имеет решающее значение для селективной трансляции ATF3 при взаимодействии с рибосомой. Однако uORFs ATF4, по-видимому, не реагируют на слипание рибосом, индуцированное анизомицином или SidI. Это позволяет предположить, что количество, длина, положение и другие характеристики uORF могут быть критическими для регуляторных эффектов. В дополнение к регуляторному uORF, неясно, является ли трансляция ATF3 невосприимчивой к слипанию рибосом, и если да, то каким образом обходится это препятствие.
тРНК — важнейшие компоненты механизма синтеза белка, что делает их основными мишенями для эффекторных токсинов, используемых патогенными микроорганизмами. Многие из этих токсинов представляют собой эндонуклеазы, которые способны расщеплять определенные тРНК, эффективно блокируя синтез белка; расщепление тРНК вызывает паузу в работе рибосом и последующий риботоксический стресс в клетках хозяина. В недавнем исследовании сообщалось, что человеческий SAMD9 функционирует как активируемая вирусом нуклеаза, которая расщепляет антикодон фенилаланиновых тРНК. При активации SAMD9 наблюдается значительная пауза рибосом на фенилаланиновых кодонах, что приводит к риботоксическому стрессу, характеризующийся выраженной индукцией ATF3. И наоборот, механизм тРНК-мимикрии направлен на прекращение трансляции, занимая А-сайт рибосомы. В случае SidI, N-концевой домен тРНК-мимикрии, по-видимому, не конкурирует с А-сайтом тРНК.
Открытие двойного механизма работы SidI открывает множество вопросов о способе его действия и влиянии на функцию рибосомы. Значительным шагом вперед стала бы визуализация структуры рибосом в комплексе с SidI при помощи криоэлектронной микроскопии. Такие исследования могут дать бесценное понимание динамики рибосом во время элонгации трансляции, и, возможно, откроют новые мишени для разработки антибиотиков.