Чтобы понять механизмы работы нейронов и нейронных цепей при том или ином типе поведенческих реакций, важно регистрировать активность нейронов мозга in vivo. Среди различных разработанных для этой цели технологий особым вниманием пользуются молекулярные инструменты, которые запускают экспрессию генов в зависимости от активности. Они позволяют выявлять причинно-следственные связи между активностью нейронов и поведением организма. В настоящем обзоре авторы обобщают сведения о недавно разработанных инструментах, в основе работы которых лежит экспрессия генов в зависимости от вида активности нервных клеток, и их потенциальный вклад в изучение нейронных цепей.

1 Введение

Выявление взаимосвязи между активностью нейронных цепей и поведением — один из наиболее важных вопросов нейробиологии. Хотя при определенном типе поведения или события активируется лишь небольшая часть нейронов, выявление этих активных нейронов и манипулирование ими дает ценную информацию о том, как нейронные цепи обрабатывают информацию и запускают действия.

Одну из наиболее перспективных и распространенных технологий исследования взаимосвязи между активностью нейронов и поведением представляет собой визуализация клеточной активности в режиме реального времени с использованием генетически кодируемых индикаторов кальция (GECI — genetically-encoded calcium indicators) или генетически кодируемых индикаторов напряжения (GEVI — genetically encoded voltage indicators) (Grewe and Helmchen, 2009; Grienberger et al., 2022). Хотя этот метод в значительной степени и прояснил корреляцию между активностью нейронов и поведением, среди его ограничений следует отметить низкую разрешающую способность по времени, ограниченные поля зрения и неспособность убедительно доказать причинно-следственные связи между ними (Lecoq et al., 2019; Grienberger et al., 2022).

Чтобы преодолеть эти ограничения, были разработаны инструменты для экспрессии экзогенных генов в активированных нейронах. Такие инструменты позволяют фиксировать активность отдельных нейронов по всему мозгу с разрешением на уровне отдельных клеток. Более того, манипулируя нейронами с помощью опсинов или «искусственно созданных рецепторов, активируемых исключительно экспериментальными препаратами» (DREADD), которые экспрессируется при использовании этих инструментов, становится возможным продемонстрировать причинно-следственные связи между активностью нейронных цепей и поведением (Mayford, 2014; Josselyn and Tonegawa, 2020).

Есть сведения о нескольких инструментах для детекции экспрессии экзогенных молекул, зависимой от активности нейронов, которые можно применять с целью маркировки активированных нейронов и манипулирования ими. В основном эти инструменты можно разделить на два типа: те, которые используют системы транскрипции, связанные с немедленно-ранними генами (IEG), и те, которые преобразуют повышение концентрации кальция, сопровождающее активность нейронов, в экспрессию репортерного гена. В этом обзоре описаны новейшие методы маркировки и манипулирования активированными нейронами, в первую очередь с упором на их применение в мозге млекопитающих.

2. Достижения в области систем экспрессии генов, зависимых от активности нейронов

2.1 Системы на основе IEG

IEG — это группа генов, содержащая Arc и c-Fos, которые подвергаются быстрой транскрипции при активации нейронов. IEG широко применяются в качестве маркеров активированных нейронов, визуализируемых с помощью таких методов, как иммуноокрашивание. Тем не менее визуализация нейронов с повышенной активностью в сочетании со специфическим поведением [организма] в течение длительного периода с использованием только экспрессии IEG является сложной задачей из-за временной экспрессии и короткого времени жизни IEG. Чтобы преодолеть данное ограничение, было разработано несколько методов экспрессии индуцируемых переключателей генов под управлением промоторов IEG, таких как, например, трансактиватор тетрациклина (tTA) и Cre.

2.1.1 TetTag

В системе TetTag (Reijmers et al., 2007) (рисунок 1А) tTA экспрессируется под контролем промотора IEG. Во время активации нейронов промотор IEG запускает экспрессию tTA, который затем связывается с элементом ответа на тетрациклин (TRE), индуцируя экспрессию трансгена. Поскольку присутствие доксициклина (Dox) ингибирует связывание tTA с TRE, концентрация Dox определяет временное окно для мечения TetTag. Реймерс с соавт. (2007) использовали мышей генетической линии c-Fos TetTag для маркировки нейронов базолатерального комплекса миндалевидного тела, которые активировались во время выработки слухового условного рефлекса, связанного с переживанием страха. Была выявлена сильная корреляция между уровнем реакции страха во время второго эпизода воздействия раздражителей и количеством нейронов, которые были помечены TetTag во время первой процедуры для выработки условного рефлекса, и которые экспрессировали IEG во время второго эпизода воздействия. Мышей TetTag также использовали в сочетании с оптогенетическими или хемогенетическим методиками. Лю и с соавт. (2012) вызывали у мышей TetTag экспрессию канального родопсина-2 только в активированных нейронах зубчатой извилины во время контекстуальной выработки условного рефлекса при переживании страха. При искусственной активации этих нейронов световыми стимулами мыши замирали, что свидетельствует о том, что повторной активации определенной популяции нейронов зубчатой ​​извилины достаточно для извлечения памяти. Кроме того, мыши TetTag широко использовались для мечения активности нейронов в гиппокампе (Ramirez et al., 2013; Tayler et al., 2013; Tanaka et al., 2014; Ohkawa et al., 2015; Okuyama et al., 2016; Pettit et al., 2022), коре больших полушарий (Stegemann et al., 2023) и спинном мозге (Groves et al., 2018).

2.1.2 TRAP and TRAP2

При направленной рекомбинации в активных популяциях (TRAP — Targeted Recombination in Active Populations) тамоксифен-зависимая рекомбиназа (CreERT2) экспрессируется под контролем промотора c-Fos или Arc (Guenthner et al., 2013; DeNardo et al., 2019) (рисунок 1B). В такой системе при активации нейрона и в присутствии тамоксифена CreERT2 проникает в ядро и вызывает рекомбинацию трансгенов, обеспечивая постоянную экспрессию репортерных белков. Временные рамки мечения TRAP определяются временем жизни тамоксифена, которое составляет примерно один день. Его производное, 4-гидрокситамоксифен (4-ОНТ), обладает более коротким временем жизни и временным интервалом TRAP, равным 12 часам, однако соединение сохраняет ту же эффективность, что и тамоксифен (Guenthner et al., 2013). У полученной первой линии мышей TRAP, также известной как TRAP1 или FosTRAP, CreERT2 была встроена в эндогенные локусы c-Fos (Guenthner et al., 2013). Следовательно, потенциально это могло нарушать физиологическую функцию Fos. Напротив, в случае с TRAP2, CreERT2 слита с C-концом эндогенного c-Fos с помощью пептида 2A. Такая конфигурация обеспечивает экспрессию CreERT2 под контролем промотора c-Fos, сохраняя при этом экспрессию белка c-Fos. Кроме того, у TRAP2 кодоны для Cre были оптимизированы. Такие усовершенствования у TRAP2 привели к повышению эффективности мечения, особенно в полосатом теле, миндалевидном теле и гипоталамусе (DeNardo et al., 2019). Также мышей TRAP или TRAP2 использовали для маркировки слуховой или моторной коры (Tasaka et al., 2018, 2020; Hwang et al., 2022), полосатого тела (Girasole et al., 2018) и гипоталамуса (Allen et al., 2017; Ishii et al., 2017). Мыши TRAP применялись для анализа активированных нейронов во всем мозге в специфических обстоятельствах путем скрещивания их с линиями мышей, которые экспрессируют репортеры благодаря рекомбинации Cre (Roy et al., 2022).

2.1.3 E-SARE and RAM

Как элемент ответа, реагирующий на усиленную синаптическую активность (E-SARE — enhanced synaptic activity-responsive element) (рисунок 1C), так и система маркировки надежной активности (RAM — Robust Activity Marking) (рисунок 1D) представляют собой синтетические промоторы, оптимизированные для повышения эффективности и специфичности мечения, зависящего от активности нейронов Они содержат активные энхансерные модули и миниатюрные промоторы IEG. E-SARE состоит из пяти тандемных повторов энхансерной области SARE, которая рекрутирует регулируемые активностью транскрипционные факторы CREB, MEF2 и SRF (Kawashima et al., 2009), и миниатюрного промотора Arc. В эксперименте со стимуляцией культивируемых нейронов для E-SARE были продемонстрированы более высокий уровень экспрессии репортеров и динамический диапазон по сравнению с промотором c-Fos (Kawashima et al., 2013). E-SARE использовался для мечения активированных нейронов в коре головного мозга (Kawashima et al., 2013; Cummings et al., 2021) и гиппокампе (Attardo et al., 2018).

RAM состоит из четырех тандемных повторов энхансерных модулей, содержащих консенсусную последовательность семейства Fos/Jun, называемую AP-1, и мотива связывания IEG Npas4, а также миниатюрного промотора c-Fos человека. Промотор RAM показал более низкую базальную экспрессию репортеров и более высокий динамический диапазон по сравнению с E-SARE (Sørensen et al., 2016). В сочетании с системой экспрессии Tet-off RAM можно использовать для регуляции времени экспрессии репортеров. Сан с соавт. (2020) заменили энхансерные модули RAM консенсусными ДНК-связывающими мотивами c-Fos или Npas4 для получения c-Fos-селективного (F-RAM) и Npas4-селективного RAM (N-RAM). С помощью N-RAM и F-RAM авторы смогли выборочно пометить ансамбли нейронов, в которых c-Fos- или Npas4-зависимый путь был усилен во время выработки контекстуального условного рефлекса, связанного с переживанием страха. Они выявили, что синаптические изменения, происходящие в каждом ансамбле, различны, а каждый ансамбль влияет на противоположные функции генерализации и дифференциации воспоминаний (Sun et al., 2020).

2.1.4 CANE

Регистрация ансамблей активированных нейронов (CANE — capturing activated neuron ensembles) (рисунок 1E) осуществляется с помощью комбинации нокинной мышиной линии, которая содержит пептид 2A-dsTVA (дестабилизированная форма рецептора А птичьего специфического онкогенного вируса) под эндогенными локусами c-Fos, и вируса бешенства или лентивируса, покрытого белком оболочки A (EnvA) (Sakurai et al., 2016). Активированные нейроны c c-Fos у нокинных мышей экспрессируют dsTVA. dsTVA позволяет вирусам, покрытым EnvA, проникать внутрь клетки, что позволяет вводить экзогенные репортерные гены исключительно в активированные нейроны. Короткий период полужизни dsTVA позволяет контролировать время экспрессии репортера путем регуляции времени между активацией нейронов и инъекцией покрытого EnvA вируса. CANE использовался для маркировки c-Fos-положительных нейронов в гипоталамусе (Sakurai et al., 2016; Jiang-Xie et al., 2019), околоводопроводном сером веществе (Tschida et al., 2019) и мосте (Rodriguez et al., 2017). Поскольку CANE можно комбинировать с покрытым EnvA вирусом бешенства, появляется шанс маркировать пресинаптические нейроны активированных нейронов посредством транссинаптической ретроградной инфекции вирусом бешенства (Michael et al., 2020).

2.2 Кальций- и светозависимые системы

Промоторы IEG и зависимые от активности искусственные промоторы используются для маркировки активированных нейронов, но среди их недостатков можно назвать недостаточную разрешающую способность по времени, охватывающую несколько часов, а также тот факт, что экспрессия IEG не всегда идеально соответствует генерации импульсов клетками (Fields et al., 1997). Чтобы преодолеть эти ограничения, были разработаны системы, в которых мечение клеток начинается только тогда, когда одновременно происходят повышение уровня кальция и воздействие света. В этих системах экспериментаторы могут контролировать продолжительность маркировки по усмотрению.

2.2.1 CaMPARI

Кальций-модулируемый фотоактивируемый ратиометрический интегратор (CaMPARI — сalcium-modulated photoactivatable ratiometric integrator) (рисунок 1F) — это белок, который претерпевает фотоконверсию из зеленого состояния в красное при одновременном повышении концентрации ионов кальция и УФ-облучении (Fosque et al., 2015). CaMPARI — производное mEos2 (McKinney et al., 2009), который подвергается необратимой фотоконверсии при освещении фиолетовым светом. Чтобы придать mEos2 кальций-чувствительную реакцию на изменение цвета, его N- и C-концы были соответственно соединены с кальций-связывающим белком кальмодулином (CaM) и его целевым пептидом M13. C помощью CaMPARI исследователи смогли пометить нейроны в связи как с их активностью, так и с УФ-излучением. CaMPARI также успешно применялся в мозге мальков рыбки данио и антенной доле дрозофилы (Fosque et al., 2015).

Было отмечено, что фотоконверсия CaMPARI происходит даже при отсутствии ионов кальция, и что эффективность фотоконверсии невысока в условиях стимуляции. Мойяэрт с соавт. (2018) выявили мутантный вариант CaMPARI, названный CaMPARI2, образовавшийся посредством мутагенеза насыщения в положениях аминокислот, окружающих хромофор флуоресцентного белка и области взаимодействия между флуоресцентным белком и чувствительными к кальцию доменами CaMPARI. По сравнению с CaMPARI новый вариант обладал более яркой флуоресценцией и пониженной фотоконверсией в условиях отсутствия кальция. Хотя скорость фотоконверсии в условиях высокого содержания кальция оставалась сопоставимой с таковой у CaMPARI, CaMPARI2 показал более медленное изменение цвета в условиях отсутствия кальция, что привело к повышению контрастности (Moeyaert et al., 2018). Ша с соавт. (2020) разработали CaMPARI с обратимым переключением (rsCaMPARI), который может переходить от яркого состояния к темному и наоборот. rsCaMPARI переключается из яркого состояния в темное при связывании кальция и воздействии синего света и возвращается в яркое состояние из темного при освещении фиолетовым светом.

Мечение CaMPARI в основном применялось для мониторинга изменений цвета в телах нейронов. Однако Перес-Альварес с соавт. (2020) предложили SynTagMA — метод, предназначенный для локализации CaMPARI2 конкретно в синапсах. С помощью слияния CaMPARI2 с синаптофизином или FingR.PSD95 — интраантителом против PSD95 (Gross et al., 2013) — они успешно нацелили CaMPARI2 на пресинаптические и постсинаптические участки соответственно. Это позволило картировать синаптическую активность.

2.2.2 Cal-Light, FLARE и FLiCRE

CaMPARI обеспечивает только «моментальные снимки» нейронов с повышенной концентрацией ионов кальция во время воздействия фиолетового света и не позволяет манипулировать популяциями нейронов с повышенной активностью с помощью оптогенетических или хемогенетических методик. Cal-Light (Lee et al., 2017) и FLARE (Fast Light- and Activity-Regulated Expression) (Wang et al., 2017) представляют собой генно-инженерные транскрипционные факторы, которые с высокой точностью по времени индуцируют экспрессию белков, включая каналородопсин, в популяциях активированных нейронов (рисунки 1G, H).

Cal-Light состоит из двух компонентов. Один компонент включает трансмембранный (TM) домен, CaM, N-концевую часть протеазы вируса гравировки табака (TEV) (TEVp-N), последовательность расщепления протеазы TEV (TEVseq), встроенную в сконструированную Jα-спираль фототропина 1 AsLOV2 (light-oxygen-voltage 2 domains from Avena sativa), и tTA. Другой компонент представляет комбинированный белок из M13 и C-концевой части протеазы TEV (TEVp-C). При активации нейронов концентрация ионов кальция в цитоплазме повышается, а связывание их с CaM в системе Cal-Light увеличивается. Связывание кальция вызывает конформационное изменение в CaM, позволяя ему взаимодействовать с M13, что сближает TEVp-N и TEVp-C. При воздействии синего света домен AsLOV2 претерпевает конформационное изменение, раскрывая таким образом TEVseq. Близкое расположение TEVp-N и TEVp-C формирует активную протеазу TEV, которая затем расщепляет TEVseq в домене AsLOV2. Такое расщепление высвобождает tTA, что позволяет экспрессировать трансген через систему Tet-OFF в ядре (Lee et al., 2017). В оригинальной версии Cal-Light иногда наблюдается спонтанная экспрессия генов. Это объясняется временным притоком кальция в синапсы и дендриты вне зависимости от потенциалов действия или высвобождением накопленного внутриклеточного кальция. Чтобы устранить влияние на фоновую экспрессию генов таких внутренних, но слабо связанных с нейронной активностью факторов, была разработана улучшенная версия транскрипционного фактора, называемая направленным на тело нейрона Cal-Light (ST-Cal-Light) (Hyun et al., 2022). ST-Cal-Light был модифицирован так, чтобы экспрессия Cal-Light была ограничена телом нейрона, с целью минимизации влияния внутренних повышений концентрации кальция. N-концевые 150 остатков субъединицы 2 каинатного рецептора, которые служат сигналом ядерной локализации в теле нейрона (Hyun et al., 2022), были вставлены между цитозольной стороной трансмембранного домена и CaM. В ST-Cal-Light уровень экспрессии остается постоянным, когда присутствуют как свет, так и кальций, в то время как фоновая экспрессия репортерного гена подавляется. Это приводит к повышению соотношения сигнал/шум по сравнению с исходной версией Cal-Light в нейронах первичной культуры гиппокампа и срезах коры больших полушарий. Используя ST-Cal-Light, удалось экспрессировать ингибирующие опсины в нейронах гиппокампа, активированных во время формирования контекстного условного рефлекса с переживанием страха, и ослабить реакцию замирания при повторном воздействии этих условий (Hyun et al., 2022).

FLARE — это молекулярный инструмент, функционирующий сходным образом и состоящий из двух компонентов. Компонент транскрипционного фактора включает домен TM Neurexin3β, последовательность нацеливания на сому нейрона Nav1.6, связывающий домен M2 CaM, полученный из MK2, TEVseq, которая встроена в сконструированный домен AsLOV2, называемый eLOV, и tTA. Протеазный компонент состоит из CaM и укороченной протеазы TEV. Подобно Cal-Light, FLARE использует кальций и синий свет для высвобождения tTA через расщепление TEVseq, что приводит к экспрессии репортерного гена (Wang et al., 2017). Поскольку эффективность экспрессии FLARE зависит от уровня экспрессии или соотношения двух его компонентов, Санчес с соавт. (2020) разработали одноцепочечный FLARE (scFLARE). Они заменили CaM и домен M2 в FLARE недавно разработанной ими кальций-чувствительной протеазой TEV (CaTEV), чтобы объединить два компонента FLARE в одну цепь. FLARE и scFLARE использовались для маркировки активированных нейронов в коре, миндалевидном теле и гиппокампе (Wang et al., 2017; Jung et al., 2023; Mocle et al., 2024).

Ким с соавт. (2020) сообщили о FLiCRE (Fast Light and Calcium-Regulated Expression), который обеспечивает более эффективную маркировку по сравнению с FLARE. В FLiCRE протеаза TEV была заменена на ультра-TEV-протеазу, называемую uTEVp (Sanchez and Ting, 2020), которая обладает более высоким числом оборотов каталитической активности. Кроме того, путем объединения ее с f-hLOV1 — усовершенствованной версией домена LOV, которая была получена путем рациональной инженерии eLOV, — была увеличена скорость реакции и достигнуто более высокое отношение сигнал/шум (Kim et al., 2020). Сообщается, что по сравнению с исходной версией Cal-Light FLiCRE демонстрирует меньшую утечку экспрессии в условиях темноты и более высокое временное разрешение в ответ на свет (Kim et al., 2020).

3 Обсуждение

Авторы обзора рассмотрели последние технологические достижения в маркировке активных нейронов и манипулировании ими. Эти инструменты внесли значительный вклад в выяснение нейронных механизмов когниции или действия. Однако в таком подходе все еще есть проблемы. Во-первых, — особенно в системах с использованием промотора IEG — разрешающая способность по времени, составляющая несколько часов, не соответствует фактическому восприятию или поведению, которые происходят в течение секунд или минут (Wang et al., 2019). В связи с этим ограничением важно отметить, что все еще существует вероятность того, что соответствующие нейроны не активируются синхронно. Хотя можно считать, что нейроны, маркированные такими системами, с большей вероятностью будут активироваться синхронно, чем случайно выбранные нервные клетки. Во-вторых, описанные инструменты не являются универсально применимыми ко всем областям мозга и всем типам клеток. Хотя во многих исследованиях сообщалось об использовании этих инструментов в гиппокампе, было отмечено, что в случае мышей линий TetTag или TRAP2 чувствительность маркировки пирамидных нейронов в областях CA1 и CA3 ниже, чем таковой для гранулярных клеток в зубчатой извилине (Deng et al., 2013; Leake et al., 2021). Кроме того, нейроны, принадлежащие к функционально различным цепям, как правило, экспрессируют разные IEG (Mahringer et al., 2022).

Инструменты для маркировки или манипуляции нейронами на основе их активности до сих пор в основном применялись для исследований, сосредоточенных на изучении того, сильно ли связаны те или иные группы нейронов, существующие в определенных регионах, с тем или иным поведением и являются ли искусственная стимуляция и торможение необходимыми или достаточными для реализации определенного поведения. Однако изучение того, как группы активированных нейронов оказываются связаны друг с другом при формировании цепей, а также как активация цепей, охватывающих несколько областей мозга, определяет поведение, в достаточной степени еще не проводилось. Понимание того, как активность нейронных цепей влияет на поведение, служит связующим звеном для объяснения корреляции между нейронной активностью и поведением. В будущем, в сочетании с новыми генетическими инструментами и методами измерения, системы экспрессии генов, зависящие от активности, позволят прояснить причинно-следственную связь между активностью нейронных цепей и поведением.