Резюме

Массовая вакцинация является многообещающим методом борьбы с глобальной пандемией COVID-19. Однако ограниченное количество и неравномерное распределение вакцин создают срочную необходимость оптимизации стратегий вакцинации. Авторы оценили антительный ответ, специфичный к SARS-CoV-2, у медицинских работников после введения вакцины Спутник V, измеряя титры IgG к S-белку и нейтрализующую способность после одной или двух доз в группе добровольцев, которые до того были или не были инфицированы вирусом. Спустя 21 день после получения первой дозы вакцины у 94 % участников, не инфицированных прежде, появились IgG, специфичные к S-белку. Единственная доза вакцины Спутник V приводит к более высоким уровням антител и способности к нейтрализации вируса у ранее инфицированных лиц по сравнению с теми, кто инфицирован не был и получил обе дозы. Высокий уровень сероконверсии после первой дозы у не перенесших инфекцию участников дает основания предположить, что для увеличения количества вакцинированных людей введение второй дозы можно отложить. Представленные данные дают сведения для принятия решений в сфере общественного здравоохранения в свете глобальной чрезвычайной ситуации, касающейся здоровья населения.

Введение

Спутник V (Гам-Ковид-Вак) представляет собой комбинированную векторную вакцину, в основе которой лежит рекомбинантный аденовирус (rAd) типа 26 и rAd5 [1]. Использование протокола, включающего две дозы, демонстрирует 91,6 % эффективность против COVID-19 [2]. В контексте текущей пандемии важный вопрос состоит в том, будет ли применение одной дозы вакцины более эффективным в плане общественного здоровья по сравнению с применением двух доз, что позволит быстрее достичь защиты населения. Вакцина, разработанная компанией AstraZeneca, которая также является двудозной и основанной на единственном векторе rAd, демонстрирует 76,0 % (59,3–85,9 %) эфективности после одной стандартной дозы [3], что позволяет предположить более длительный интервал между двумя дозами. В случае мРНК-вакцин — mRNA-1273 (Moderna) и BNT162b2 (Pfizer) ранее перенесшие инфекцию лица могут приобрести достаточный иммунитет после одной дозы, без явной пользы применения двухфазного протокола [4, 5].

Результаты

Авторы измерили антительный ответ и способность нейтрализовать вирус у участников, получавших одну или две дозы вакцины Спутник V, с или без предшествующей инфекции SARS-CoV-2 (N = 227 и N = 62 соответственно). Образцы плазмы были взяты трижды: до вакцинации (исходный уровень), через 21 день после первой дозы и через 21 день после второй дозы. Содержание IgG к S-белку SARS-CoV-2 измеряли с помощью описанного ранее твердофазного иммуноферментного анализа путем титрования [6] и количественного измерения по Международному стандарту ВОЗ для сравнения данных из различных лабораторий [7]. Нейтрализующие вирус антитела измеряли с помощью SARS-CoV-2 дикого типа (WT) и псевдотипированного S-белка VSV, экспрессирующего GFP [8].

После первой дозы вакцины Спутник V у 94 % участников с исходно отрицательной серологической реакцией выявился положительный ответ IgG против SARS-CoV-2 со средним геометрическим титра (СГТ) 244 (ДИ 95 %, 180–328) (Рисунок 1A). Разделение участников по возрасту продемонстрировало сероконверсию у 96 % и 89 % лиц младше и старше 60 лет соответственно (Рисунок 1B). После второй дозы сероконверсию продемонстрировали 100 % участников с СГТ 2148 (ДИ 95 % 1742–2649). У участников, исходно имевших антитела против SARS-CoV-2, появились высокие титры антител спустя 21 день после получения первой дозы вакцины. СГТ составляло 531 (ДИ 95 %, 380–742) до и 9850 (ДИ 95 %, 8460–11480) после первой дозы, что демонстрирует 19-кратное увеличение уровня специфических антител. Напротив, титры IgG к S-белку значительно не отличались после одной и двух доз: СГТ составило 9850 (ДИ 95 %, 8460–11480) и 9590 (ДИ 95 %, 7410–12408) соответственно.
 

Для возможности сравнения результатов из разных лабораторий уровни IgG выражались в Международных единицах (МЕ) после нормализации, в соответствии с Международным стандартом ВОЗ для антител против SARS-CoV-2 (Рисунок 1C). Среднее геометрическое (СГ) концентраций IgG в МЕ/мл составляло 104,2 (ДИ 95 %, 92,3–157,5) после первой дозы и 787,8 (ДИ 95 %, 626,0–936,2) после второй дозы у лиц, не инфицированных вирусом ранее, и 181,1 (ДИ 95 %, 105,2–243,7), 6356 (ДИ 95 %, 5409–14 763) и 5609 (ДИ 95 %, 3621–8496) для исходного уровня одной и двух доз, соответственно у лиц, перенесших инфекцию.

Примечательно, что титры антител после одной дозы у участников с имеющимся иммунитетом были значительно выше, чем у тех вакцинированных, кто не был инфицирован и получил одну или даже две дозы (P < 0,0001, двусторонний критерий Манна-Уитни). СГТ для участников, перенесших инфекцию ранее, было в 40 и 4,6 раз выше, чем таковое у неинфицированных лиц после получения одной или двух доз соответственно (Рисунок 1A). Это демонстрирует мощный ответ на вакцинацию у перенесших инфекцию лиц, на основе чего можно предполагать, что приобретенный естественным образом иммунитет может быть достаточно усилен с помощью единственной дозы, что согласуется с недавними данными из исследований, посвященных вакцинам на основе мРНК [4, 5].

Нейтрализующую способность оценивали путем измерения титров нейтрализующих антител на исходном уровне для сероположительных и сероотрицательных лиц, используя SARS-CoV-2 дикого типа или псевдовирусную инфекцию CoV2pp GFP. Для SARS-CoV-2 дикого типа нейтрализующие титры определяли как наибольшее разведение сыворотки без какого-либо цитопатического эффекта по отношению к монослою, а для псевдотипированного вируса была определена концентрация антител, ингибирующая инфекцию на 80 % (IC80) (см. Рисунок 2, Journal Pre-proof, для 50 % ингибирования инфекции, IC50, см. дополнительный Рисунок S1). Через 21 день после получения первой дозы нейтрализующие антитела определялись у 90 % не инфицированных ранее участников (исходно сероотрицательных), с СГ титров нейтрализующих антител, равным 12 (ДИ 95 %, 10–14) для WT SARS-CoV-2 (Рисунок 2, левая панель). СГ титров нейтрализующих антител после полной вакцинации двумя дозами у неинфицированных лиц составлял 42 (ДИ 95 %, 33–53) (Рисунок 2, левая), что выше, нежели у выздоравливающих лиц (исходно сероположительных) до вакцинации: оно было равно 28 (ДИ 95 %, 23–40) (Рисунок 2, правая). Примечательно, что резкое увеличение активности нейтрализующих антител после первой дозы обнаруживалось у участников, ранее перенесших инфекцию. В этом случае СГ титров нейтрализующих антител было 500 (ДИ 95 % 341–732) и 782 (ДИ 95 % 557–1099) после инфекции WT и псевдотипированным вирусом соответственно (Рисунок 2, правая панель). Это указывает на то, что одна доза вакцины запускает масштабную продукцию нейтрализующих антител у выздоравливающих людей, которая не увеличивается после второй дозы.
 

Заключение

Данное исследование предлагает новые данные, касающиеся антительного ответа на действие вакцины Спутник V у добровольцев, которые прежде перенесли или не перенесли инфекцию SARS-CoV-2. Авторы обнаружили высокий уровень сероконверсии у не инфицированных ранее лиц после одной дозы вакцины. В целом 94 % вакцинированных продемонстрировали специфический антительный ответ, определяющийся по антителам к S-белку, при этом у 90 % выявлена нейтрализующая активность по отношению к вирусу дикого типа. Важно отметить, что одна доза вакцины Спутник V вызывает быстрый и интенсивный иммунный ответ у сероположительных участников с нейтрализующими титрами, превышающими таковые у сероотрицательных участников, получивших обе дозы. Несмотря на то, что сообщалось о защитной роли антител к S-белку против COVID-19, уровень защиты, необходимый для достижения фактической защиты от инфекции, остается неопределенным, и для определения минимального порога, который требуется для защиты, необходимы дальнейшие исследования эффективности в комбинации с количественным изучением уровня антител против S-белка. Представление полученных данные в МЕ позволяет сравнивать измерения, полученные с использованием различных технологий, что помогает определять уровни антител, связанных с защитой после вакцинации. Данные, основанные на количественной информации, помогут определять стратегии внедрения вакцин в условиях общемировых ограничений поставок вакцин.
 

Ограничения исследования

Данное исследование демонстрирует высокий уровень гуморального ответа после применения вакцины Спутник V в группе из 288 добровольцев из более чем 200 000 вакцинированных медицинских работников. Однако изучение эффективности еще не завершено, и в будущем необходимо достичь защиты населения с помощью вакцины и определить корреляцию с титрами антител. Помимо этого, необходимы долгосрочные исследования дальнейшего состояния для оценки длительности иммунного ответа.

Модель эксперимента и данные об участниках

Участники и образцы

В данном исследовании отслеживается гуморальный иммунный ответ у медицинских работников, которые получили вакцину Спутник V, с течением времени. Исследование было начато в январе 2021 года и продолжается в настоящее время. Было получено этическое одобрение центрального комитета Министерства здравоохранения г. Буэнос-Айрес, все участники перед сбором данных и получением образцов подписали информированное согласие (Cod#2021-00983502). Образцы крови для получения собирали путем венопункции в пробирки SST (BD Sciences) для сыворотки и хранились при −20 °C. Перед исследованием сыворотки для выявления антител все образцы были деидентифицированы.

Культуры клеток

Клетки линий Vero E6 (ATCC) и 293T ACE2/TMPRSS2 были любезно предоставлены Dr. Benhur Lee и культивировались при 37 °C в 5 % CO₂ в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (Thermo Fisher Scientific) с добавлением 10 % фетальной сыворотки теленка (FBS) (Gibco).

Рекомбинантный VSV

«Запасы» вируса (VSV-eGFP-SARS-CoV-2), созданные в лаборатории Sean Whelan [8], были амплифицированы в лаборатории авторов статьи с использованием клеток 293T ACE2/TMPRSS2 при MOI величиной 0,01 в среде DMEM, содержащей 2 % FBS при 37 ºC. Вирусные супернатанты были отобраны по обширному цитопатическому эффекту и GFP-положительным клеткам. Среду очищали путем центрифугирования при 1000 g в течение 5 мин. Вирус титровали в виде формирующих флуоресценцию единиц на миллилитр (UFF/мл) в клетках линии Vero. Аликвоты хранили при –80 ºC.

SARS-CoV-2

Штамм SARS-CoV-2 2019 hCoV-19/Argentina/PAIS-G0001/2020 предоставила Dr. Sandra Gallegos (рабочая группа InViV). Вирус пассировали в клетках Vero E6. Работа с SARS-CoV-2 одобрена Институциональным комитетом по биобезопасности INBIRS при 3 уровне биобезопасности с отрицательным давлением.

Детали метода

Определение антител против SARS-CoV-2 методом ELISA

Антитела к S-белку SARS-CoV-2 определяли двухэтапным методом ELISA, как описано ранее [6]. При этом методе плато покрывается смесью S-белка и рецептор-связывающего домена (RBD). Для получения конечных титров получали серию разведений образцов в сыворотке, негативной по IgG к SARS-CoV-2 или фетальной сыворотке теленка (FBS) от 1/50 до 1/12800. Концентрация антител против SARS-CoV-2 в каждом образце выражена в Международных единицах на мл (МЕ/мл) [7] и была вычислена путем экстраполяции оптической плотности (ОП) при 450 нм на калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой авторы определяли ОП при 450 в серии разведений для иммуноглобулинов против SARS-CoV-2 согласно Международному стандарту ВОЗ. Использованный линейный диапазон составлял 0,2–1,5 ОП при 450 нм. Таким образом, авторы выполнили серию разведений образцов для нахождения условий, при которых ОП при 450 нм в каждом образце адекватно попадает в линейный диапазон.

Оценка способности к нейтрализации SARS-CoV-2

Образцы сыворотки были инактивированы при 56 °C в течение 30 мин. Серийные разведения от 1/2 до 1/8192 инкубировали 1 ч при 37 ºC в присутствии WT SARS-CoV-2 (hCoV-19/Argentina/PAIS-G0001/2020, GISAID Accession ID: EPI_ISL_499083) в DMEM с 2 % FBS. 50 мкл смеси затем наносили на монослой клеток Vero на 1 ч при 37 °C (MOI = 0,01). Инфекционную среду устраняли и замещали DMEM с 2 % FBS. Спустя 72 ч клетки фиксировали 4 % параформальдегидом (4 °C 20 мин) и окрашивали раствором кристаллического фиолетового в метаноле. Цитопатический эффект (ЦПЭ) вируса по отношению к монослою оценивали визуально: даже если в лунке выявлялось небольшое повреждение монослоя (1–2 «пятна»), она рассматривалась как лунка с проявлением ЦПЭ. Титр нейтрализации определяли нак наибольшее разведение сыворотки, воспроизводимо не вызывающее ЦПЭ в двух или трех лунках.

Исследование нейтрализации псевдовируса

Нейтрализацию оценивали с помощью псевдотипированных частиц SARS-CoV-2 (CoV2pp-GFP), созданных в лаборатории Sean Whelan [8]. CoV2pp-GFP в качестве основы содержит вирус везикулярного стоматита с геном E вместо гена гликопротеина G (VSV-eGFP-SARS-CoV-2), и экспрессирует в своей оболочке полноразмерный S-белок дикого типа из Уханя. Для анализа использовали клетки Vero, которые культивировали в среде DMEM c высоким содержанием глюкозы и 10 % FBS и за день до инфицирования посажены в 96-луночное плато. Сыворотку пациентов инактивировали при 56 °C в течение 30 минут и приготавливали серийные разведения в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы. Нейтрализацию сыворотки проводили, сначала разводя инактивированный образец двукратно и далее — проводя серийные двукратные разведения. Предварительно оттитрованное количество псведотипированных частиц перед инфицированием инкубировали с двукратными серийными разведениями сыворотки пациента в течение 1 часа при 37 ºC. Далее клетки фиксировали 4 % формальдегидом, содержащим ядерный краситель DAPI (Invitrogen) в концентрации 2 мкг /мл в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего фиксатор замещали на PBS. Изображения получали с помощью автоматизированного микроскопа InCell 2000 Analyzer (GE Healthcare) в каналах DAPI FITC для визуализации ядер и инфицированных клеток (например, eGFP-положительных клеток) соответственно (объектив 4×, 4 поля на лунку с покрытием всей лунки). Изображения анализировали с помощью многоцелевого аналитического модуля (Multi Target Analysis Module) анализатора InCell Analyzer 2000 Workstation Software (GE Healthcare). GFP-положительные клетки определяли в канале FITC методом цилиндрической сегментации и затем считали с помощью программного обеспечения InCell Workstation. Величину абсолютной ингибирующей концентрации (absIC) для образцов сыворотки пациентов рассчитывали с применением модели четырехпараметрической логистической (4PL) регрессии в GraphPad Prism 8. Модель 4PL описывает сигмоидную картину ответа. Для ясности принималось, что ответ можно представить таким образом, что наклон кривой нарастает с увеличением концентрации. Абсолютная ингибирующая концентрация (absIC) рассчитывалась как соответствующая точка между 0 % и 100 % контролями. В контролях для всех образцов в одном плато было определено 80 % ингибирование. Так, absIC80 должна быть точкой, при которой кривая совпадает с ингибированием в 80 % из 100% контроля в анализе относительно минимума в анализе. Более того, с помощью моделирования с четырехпараметрической (4PL) логистической регрессией в GraphPad prisms 8 было рассчитано 50 % ингибирование.

Количественная оценка и статистический анализ

Все оценки статистических критериев и построение графиков были выполнены с применением GraphPad Prism 8.0. Сравнение титров антител в различных временных точках (Рисунок 1A, Рисунок 2 и Рисунок 1S) проводили с помощью U-критерия Манна-Уитни. Статистическая значимость указана в подписях к рисунках следующим образом: ****:p < 0,0001; нз: не значимо. Среднее геометрическое с доверительным интервалом 95 % рассчитано во всех временных точках. На всех рисунках N представляет число проанализированных образцов человеческой сыворотки.