CRISPR: от кишечной палочки до палочек и колбочек

Автор: Мария Пешкова
Оформление: Никита Родионов
Публикация: 15.02.2021

Открытие CRISPR, как и все гениальное в науке, было сделано почти случайно. В 1987 году японские ученые из Университета Осаки секвенировали ген iap кишечной палочки, изучили его белковые продукты и, поскольку ResearchGate тогда еще не было, честно написали в разделе «Обсуждения» следующее: коллеги, на 3'-конце нашего гена — какие-то странные повторяющиеся последовательности по 29 нуклеотидов, между ними — не повторяющиеся, по 32, глубокий биологический смысл от нас пока ускользает.

Спустя несколько лет испанец Франсиско Мохика из Университета Аликанте, секвенируя для докторской геном архей-галофилов, обратил внимание, что и у них в ДНК есть множество коротких повторяющихся последовательностей, которые перемежаются неповторяющимися (правда, эти последовательности отличались от тех, что японцы нашли у эшерихий) и предположил, что они каким-то образом регулируют экспрессию генов.

В лихие девяностые, с развитием технологий секвенирования, ученые по всему миру начали играть с геномами и — сюрприз! — прокариоты, от гемофильной палочки до чумной, раз за разом выдавали в геноме одну и ту же структуру: короткие палиндромные повторы, перемежающиеся вставками (спейсерами), которые каждая научная группа называла как душе угодно: кто — SRSRs (short regularly spaced repeats), кто — SPIDRs (spacers interspersed direct repeats), а кто-то даже LCTRs (large cluster of tandem repeats). Наконец, мировое научное сообщество сошлось на CRISPR.

Группа голландских ученых, к 2002 году насеквенировав массу геномов прокариот, обратила внимание, что к CRISPR всегда прилегает однотипная группа генов. Глубокий биологический смысл опять ускользал, поэтому гены окрестили просто: Cas — CRISPR-associated.

База данных с последовательностями ДНК расширялась. В 2005 году все тот же Франсиско Мохика обнаружил совпадение одного из спейсеров кишечной палочки и фрагмента ДНК бактериофага P1, и практически одновременно две группы французских ученых обнаружили совпадение фрагментов ДНК других фагов и спейсеров чумной палочки и нескольких стрептококковых штаммов. Родилась гипотеза: система CRISPR-cas связана с приобретенным иммунитетом прокариот. Проверить ее было нетрудно: культуры микроорганизмов заражали фагами, а затем искали в геноме новые спейсеры. Гипотеза подтвердилась. Началась эра CRISPR.

Далее события развивались стремительно: пять лет прошли под лозунгом «хотим делать так же in vitro, а потом на эукариотах in vivo». Итак, к 2010 году были обнаружены особым образом процессируемая CRISPR-РНК (crРНК) и молекула-активатор tracrРНК, обеспечивающая этот процессинг, а также открыта функция белков Cas — нуклеаз, разрезающих мишень, которая связалась с направляющим комплексом crРНК и tracrРНК). Этот мини-набор юного генного инженера (crРНК–tracrРНК–Cas9) позволил группе литовских ученых в 2011 году перенести CRISPR-систему из стрептококка в кишечную палочку. Вскоре система была упрощена соединением crРНК и tracrРНК в одну молекулу, названную sgРНК, а уже к 2013 группой Чжана Фэна была опубликована одна из наиболее цитируемых статей, посвященных CRISPR, описывающая редактирование генома эукариот: эксперименты проводились на клетках нейробластомы мыши и клеточной линии эмбриональных почек человека.

Вам тоже уже не терпится начать лечить пациентов? Вперед!

CRISPR может сослужить неплохую службу в терапии ex vivo — на клетках крови. Например, если отключить в гемопоэтических стволовых клетках больных бета-талассемией или серповидноклеточной анемией ген BCL111A, а затем вернуть их в кровоток, то мы тем самым настроим дифференцирующиеся из них эритроциты на синтез фетального вместо дефектного «взрослого» гемоглобина. Фетальный гемоглобин менее стабилен, чем гемоглобин А, но все же выполняет свою функцию куда лучше мутантного белка, а состояние пациентов значительно улучшается, что демонстрируют клинические исследования, запущенные в последние несколько лет в Европе и США.

Кроме того, в настоящее время при помощи технологии CRISPR совершенствуется CAR-T терапия — метод лечения онкозаболеваний аутологичными Т-клетками с химерными антигенными рецепторами: нокаутируя определенные гены в Т-лимфоцитах, можно добиться их большей устойчивости и избирательности.

А если мы хотим лечить непременно in vivo? Что же, у одного из лучших друзей биологов и их самой элегантной модели, червячка C. elegans, в организме около 1000 клеток. А у человека — триллионы. Редактировать и редактировать. А если вы сейчас подумали про эмбрионы, то забудьте: эмбрион вам информированного согласия на исследования не подпишет. Ведь никто и не обещал, что будет легко.

Но не расстраивайтесь, еще не все потеряно. На взрослых животных моделях за последние несколько лет все же удалось сделать немало: повысить экспрессию дистрофина у мышей, свиней и собак с миодистрофией Дюшенна, снизить уровень фенилаланина в крови у мышей с фенилкетонурией, замедлить на мышиных моделях развитие болезни Альцгеймера и бокового амиотрофического склероза. Да, мы не можем щелкнуть CRISPR-ножницами один раз на стадии зиготы, чтобы убрать смущающую нас мутацию во всех будущих клетках человеческого организма, поэтому при генной терапии in vivo на взрослом организме мы можем ожидать не полного излечения, но снижения прогрессирования заболеваний, смягчения симптомов, улучшения прогноза.

Весной 2020 года в США впервые начались клинические испытания CRISPR-терапии in vivo. Пациенту с амаврозом Лебера 10 типа была проведена внутриглазная инъекция препарата для редактирования точечной мутации в гене СЕР290, вызывающей нарушение функционирования палочек и колбочек. О результатах говорить пока рано, однако исследователи настроены весьма оптимистично. Пожелаем им успехов!

Источники:

  1. Ishino, Y., Krupovic, M., & Forterre, P. (2018). History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. Journal of bacteriology, 200(7), e00580-17. https://doi.org/10.1128/JB.005...
  2. Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., & Nakata, A. (1987). Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. Journal of bacteriology, 169(12), 5429–5433. https://doi.org/10.1128/jb.169...
  3. Mojica, F. J., Juez, G., & Rodríguez-Valera, F. (1993). Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites. Molecular microbiology, 9(3), 613–621. https://doi.org/10.1111/j.1365...
  4. Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W., & Schouls, L. M. (2002). Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Molecular microbiology, 43(6), 1565–1575. https://doi.org/10.1046/j.1365...
  5. Mojica, F. J., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., & Soria, E. (2005). Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. Journal of molecular evolution, 60(2), 174–182. https://doi.org/10.1007/s00239...
  6. Pourcel, C., Salvignol, G., & Vergnaud, G. (2005). CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology (Reading, England), 151(Pt 3), 653–663. https://doi.org/10.1099/mic.0....
  7. Bolotin, A., Quinquis, B., Sorokin, A., & Ehrlich, S. D. (2005). Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology (Reading, England), 151(Pt 8), 2551–2561. https://doi.org/10.1099/mic.0....
  8. Sapranauskas, R., Gasiunas, G., Fremaux, C., Barrangou, R., Horvath, P., & Siksnys, V. (2011). The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research, 39(21), 9275–9282. https://doi.org/10.1093/nar/gk...
  9. Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P. D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L. A., & Zhang, F. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science (New York, N.Y.), 339(6121), 819–823. https://doi.org/10.1126/scienc...
  10. González-Romero, E., Martínez-Valiente, C., García-Ruiz, C., Vázquez-Manrique, R. P., Cervera, J., & Sanjuan-Pla, A. (2019). CRISPR to fix bad blood: a new tool in basic and clinical hematology. Haematologica, 104(5), 881–893. https://doi.org/10.3324/haemat...
  11. Li, C., Mei, H., & Hu, Y. (2020). Applications and explorations of CRISPR/Cas9 in CAR T-cell therapy. Briefings in functional genomics, 19(3), 175–182. https://doi.org/10.1093/bfgp/e...
  12. Amoasii, L., Hildyard, J., Li, H., Sanchez-Ortiz, E., Mireault, A., Caballero, D., Harron, R., Stathopoulou, T. R., Massey, C., Shelton, J. M., Bassel-Duby, R., Piercy, R. J., & Olson, E. N. (2018). Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science (New York, N.Y.), 362(6410), 86–91. https://doi.org/10.1126/scienc...
  13. Moretti, A., Fonteyne, L., Giesert, F., Hoppmann, P., Meier, A. B., Bozoglu, T., Baehr, A., Schneider, C. M., Sinnecker, D., Klett, K., Fröhlich, T., Rahman, F. A., Haufe, T., Sun, S., Jurisch, V., Kessler, B., Hinkel, R., Dirschinger, R., Martens, E., Jilek, C., … Kupatt, C. (2020). Somatic gene editing ameliorates skeletal and cardiac muscle failure in pig and human models of Duchenne muscular dystrophy. Nature medicine, 26(2), 207–214. https://doi.org/10.1038/s41591...
  14. El Refaey, M., Xu, L., Gao, Y., Canan, B. D., Adesanya, T., Warner, S. C., Akagi, K., Symer, D. E., Mohler, P. J., Ma, J., Janssen, P., & Han, R. (2017). In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation research, 121(8), 923–929. https://doi.org/10.1161/CIRCRE...
  15. Villiger, L., Grisch-Chan, H. M., Lindsay, H., Ringnalda, F., Pogliano, C. B., Allegri, G., Fingerhut, R., Häberle, J., Matos, J., Robinson, M. D., Thöny, B., & Schwank, G. (2018). Treatment of a metabolic liver disease by in vivo genome base editing in adult mice. Nature medicine, 24(10), 1519–1525. https://doi.org/10.1038/s41591...
  16. Park, H., Oh, J., Shim, G., Cho, B., Chang, Y., Kim, S., Baek, S., Kim, H., Shin, J., Choi, H., Yoo, J., Kim, J., Jun, W., Lee, M., Lengner, C. J., Oh, Y. K., & Kim, J. (2019). In vivo neuronal gene editing via CRISPR-Cas9 amphiphilic nanocomplexes alleviates deficits in mouse models of Alzheimer's disease. Nature neuroscience, 22(4), 524–528. https://doi.org/10.1038/s41593...
  17. Lim, C., Gapinske, M., Brooks, A. K., Woods, W. S., Powell, J. E., Zeballos C, M. A., Winter, J., Perez-Pinera, P., & Gaj, T. (2020). Treatment of a Mouse Model of ALS by In Vivo Base Editing. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy, 28(4), 1177–1189. https://doi.org/10.1016/j.ymth...
  18. Ledford H. (2020). CRISPR treatment inserted directly into the body for first time. Nature, 579(7798), 185. https://doi.org/10.1038/d41586...
Нашли опечатку? Выделите фрагмент и нажмите Ctrl+Enter.