Клиническая химия: аминокислоты и белки
Мало какие аминокислоты интересуют врача в повседневной практике. В основном методы их определения используются при подозрении на врожденную патологию обмена аминокислот. Тут всем на ум должна была прийти фенилкетонурия.
Для освежения памяти: фенилаланин-4-гидроксилаза катализирует превращение фенилаланина в тирозин. При недостаточности этого фермента фенилаланин окисляется до фенилпировиноградной и фенилмолочной кислот, оказывающих токсическое действие на организм. Второй важной аминокислотой, а точнее ее производным является гомоцистеин, который часто повышается при развитии сердечно-сосудистых заболеваний и при тромбообразовании. Аминокислоты также часто становятся объектом клинических исследований. Существенно значимым является увеличение их концентрации вдвое выше нормы. При ФКУ или лейцинозе (болезнь «кленового сиропа») характерны показатели, превышающие норму в 10-20.
В случае аминокислот исследованию подвергается плазма или сыворотка крови (хранится при комнатной температуре 1 день или в холодильнике максимально неделю) или же суточная моча (хранится охлажденной или при помощи консерванта тимола в изопропаноле). При скрининге новорожденных используют тест Гатри, который по сути представляет собой ни что иное как картон, смачиваемый каплями крови тестируемого.
Существуют и более дорогие методы скрининга: тандемная масс-спектрометрия для диагностики нарушений обмена аминокислот и карнитина, ионообменная хроматография (с помощью которой возможно разделить аминокислоты, после чего их смешивают с нингидрином и определяют фотометрически), а также многочисленные молекулярно-генетические методы.
Физиологическая норма отличается в каждом отдельном случае в зависимости от метода измерения, возраста и питания пациента. Также стоит учитывать, что с течением времени в пробе наблюдается снижение концентрации глутамина и аспарагина, а глутаминовой и аспарагиновой кислот, напротив, увеличиваются. Об этом стоит помнить при длительной транспортировке крови до лаборатории.
О функциях различных белков можно говорить часами и читать толстые главы в учебниках. Остановится сначала на общих аспектах.
Самым старым методом выявления протеинов является метод Кьельдаля. Он основан на реакциях окисления пробы с последующим выделением аммиака с помощью дистилляции и его титрованием. Как вы уже догадываетесь, рассчитанное значение не будет специфичным: в крови помимо аминокислот находится много других соединений, содержащих азот, например, (как минимум) мочевина и мочевая кислота. Поэтому перед обработкой необходимо выделить все протеины из плазмы.
В настоящее время чаще используют биуретовый метод: ионы меди связывают (согласно различным источникам) четыре или шесть атомов азота, в результате чего в щелочной среде образовываются красно-фиолетовые комплексы, которые возможно фотометрически детектировать при 546 нм. Тартрат, содержащийся в смеси для исследования образует комплекс с ионами меди, который в щелочной среде возможно осадить в виде нерастворимого гидроксида меди. Йодид , также добавляемой в пробу, предупреждает восстановление меди. Интенсивность цвета пропорциональна количеству пептидных связей. Таким образом, с помощью метода невозможно установить структуру белка, но возможно определить его общую концентрацию.
Если же проба мала для исследования вышеуказанным методом, прибегают к методу Лоури, при которой используют фосфомолибдат/фосфовольфрамат.
При проведении биуретовой пробы также невозможно определить количество белка в спинномозговой жидкости и моче. В этом случае обычно сперва осаждают белки с помощью трихлоруксусной кислоты, центрифугируют, а затем с помощью гидроксида натрия снова переводят в раствор. Также к пробам с малым содержанием протеинов часто добавляют пигменты, связывающие их в кислой среде. Например, пирогаллол красный, молибдат или кумасси бриллиантовый синий.
Не нужно специальных знаний, чтобы представить себе причины нарушения концентрации белков: как и в случае любой концентрации, тут может изменится или количество вещества в растворителе, или же растворителя станет больше или меньше, что тоже изменит концентрацию. Чтобы определить , какие именно протеины повлияли на это значение устанавливают, во-первых, показатель гематокрита, а во-вторых, проводят электрофорез сыворотки крови. Для этого на анализ берут сыворотку или плазму крови. Следует учитывать, что концентрация протеинов также зависит от положения тела и длительности венозного застоя во время взятия пробы. Эти два фактора вызывают отклонения на 10% от истинного значения.
Биуретовый метод очень чувствителен к нескольким факторам: если в крови содержится большое количество жиров, или проба по другим причинам является мутной (например, введение растворов декстрана), то результаты метода могут оказаться завышенными. В некоторых инфузионных растворах также содержатся протеины (дериваты желатина). Сорбит и маннит, а также высокие концентрации глюкозы и фруктозы также могут привести к завышенным результатам теста. Гемолиз и высокие концентрации билирубина в плазме крови также могут влиять на результаты.
Общее количество протеина в крови у новорожденных в норме составляет 46-68 г/л, у детей старшего возраста 60-80 г/л, а у взрослых 66-83 г/л. Чаще всего причиной изменения концентрации белков (за исключением дегидратации, гипергидратации и потери протеинов в результате кровотечения или нарушений всасывания) являются уменьшение количества альбуминов или же повышение количества иммуноглобулинов.
Гипопротеинемия может также быть следствием врожденных нарушений (анальбуминемия) или же приобретенных (нарушение синтеза альбумина в результате поражений печени (гепатит, некроз клеток печени), нарушения всасывания (например, при цистическом фиброзе), а также при недостаточном потреблении протеинов (алиментарный маразм, квашиоркор). Снижение концентрации альбумина может также быть следствием нефротического синдрома и гломерулонефрита (потеря альбумина через почки), экссудативной энтеропатии (язвенный колит, болезнь Крона), потери альбумина после ожогов через кожу, или же после пункции асцита или жидкости из плевральной полости.
Псевдогипопротеинемию наблюдают при повышении жидкости в организме в результате инфузионной терапии, при потери крови, а также во время беременности.
Гиперпротеинемия часто является следствием повышения фракции гамма-протеинов в сыворотки крови. Причиной также может быть моноклональная гаммапатия, при которой концентрация протеинов может достигать 140 г/л. Псевдогиперпротеинемия наступает при потере большого количества жидкости вследствие эксикоза (жажда, diabetes insipidus или при сильном поносе).
Для проведения электрофореза используют сыворотку или плазму крови. В последнем случае в пробу дополнительно добавляют тромбин, а также отделяют пробу от фибриногена. Исследование мочи также возможно с помощью этого метода.
Каждая фракция глобулинов содержит множество протеинов, выполняющих разные функции. Поэтому для определения конкретного нарушения всегда требуются дополнительные иммунологические тесты.
Для интерпретации анализов белков плазмы крови необходимо знать функции отдельных ее составляющих. В зависимости от молекулярной массы и заряда молекул, для каждой группы протеинов плазмы характерен определенный характер движения в электрическом поле при электрофорезе в геле. В зависимости от этого различают несколько групп белков:
— Преальбумин (транстиретин) — участвует в связывании тироксина, трийодтиронина и ретинол-связывающего протеина;
— Альбумины — поддерживают онкотическое давление крови, осуществляют транспорт ионов, билирубина, гормонов, лекарственных средств;
— К фракции альфа-1-глобулинов относятся транскортин (отвечает за синтез кортизола), альфа-1-кислый гликопротеин (орозомукоид), ингибиторы протеаз (альфа-1-антитрипсин, антихимотрипсин);
— На границе между альфа-1 и альфа-2 глобулинами обычно располагаются тироксин-связывающий глобулин и интер-альфа-ингибитор трипсина;
— К альфа-2 фракции глобулинов относят участвующий в синтезе гемоглобина гаптоглобин, ретинол-связывающий протеин, альфа-2-микроглобулин, антитромбин III, псевдохолинэстеразу, С1-ингибитор, альфа-2-антиплазмин;
— К фазе бета-глобулинов относят трансферрин, бета-гликопротеин-1, С-реактивный белок, гемопексин, плазминоген;
— На границе гамма-фазы располагаются иммуноглобулин А, бета-2-микроглобулин, С3. Гамма-фракцию составляют исключительно иммуноглобулины (G,M,D,E).
Обычно электрофорез выглядит так, как мы его и привыкли видеть, однако при некоторых заболеваниях именно этот метод анализа помогает выявить, какая из фракций плазмы крови представлена в не характерном для нее количестве. Моноклональные гаммапатии встречаются при плазмоцитоме, болезни Вальденстрема, а также при увеличении концентрации тяжелых цепей иммуноглобулинов в плазме крови. Увеличение белков альфа-1 и альфа-2 фракций характерно для острых воспалительных процессов, снижение доли альбумина в крови при одновременном увеличении альфа-2 и бета-фракций может быть свидетельством нефротического синдрома. Увеличение белков гамма-фракции при одновременном снижении концентрации альбумина встречается при циррозе печени. Равномерное уменьшение всех белков фракции иммуноглобулинов свидетельствует о недостаточности антител. Если при анализе ошибочно использовалась цельная плазма крови, а не ее сыворотка, то результаты анализа можно спутать с таковыми при моноклональной гаммапатии.
Классическим примером заболевания, диагностика которого проводится посредством электрофореза белков крови, является талассемия. При этом заболевании нарушается синтез глобиновых цепей, что приводит к гипохромной микроцитарной анемии. В мазке крови наблюдаются характерные для этого заболевания таргетные клетки. Хронический гемолиз приводит к гемосидерозу тканей с вторичным поражением органов и нарушением их функций (сердце, печень, поджелудочная железа, почки). Из-за хронически сниженной концентрации гемоглобина организм постоянно испытывает гипоксию, что приводит к замедлению процессов роста тканей и ломкости костей вследствие разрастания костного мозга. При тяжелых формах талассемии также наблюдается спленомегалия.
При бета-талассемии из-за сниженного синтеза бета-цепей компенсаторно увеличивается синтез гамма- и сигма-цепей глобина, фетального гемоглобина (HbF > 2 %) и HbA2 (> 3 %). Альфа-цепи образуют агрегаты, что в процессе созревания эритроцитов приводит к их гемолизу, делая процесс гемопоэза неэффективным. При анемии Кули (большая форма талассемии с полным отсутствием бета-цепей) анемия развивается уже в детском возрасте: наблюдается гиперплазия костного мозга, что заметно по внешнему вида ребенка из-за неравномерно развитых костей, спленомегалия и гемосидероз. При промежуточной форме талассемии (синтез бета-цепей сильно снижен) анемия протекает более мягко — рост детей в норме, иногда наблюдается желтуха. Симптомами обычно являются спленомегалия, выпирание нижней челюсти, образование камней в желчных протоках, сердечная недостаточность из-за гемосидероза. При малой форме (синтез бета-цепей снижен незначительно) многие пациенты не жалуются на вышеупомянутые симптомы, однако часто у них наблюдается анемия легкой степени тяжести.
При альфа-талассемии снижается синтез альфа-цепей. Компенсаторно увеличивается синтез бета-цепей, из-за чего образуется тетрамерный гемоглобин H (HbH), наличие которого позволяет идентифицировать поврежденные клетки в мазке крови с помощью специальных методов окрашивания препарата. Пренатально увеличивается синтез гамма-цепей. В отличие от бета-талассемии, в данном случае постановка диагноза на основе электрофореза невозможна, поскольку соотношение HbF к HbA2 остается в норме. HbH не влияет на электрофорез, но усиливает гемолиз за счет повреждения мембраны эритроцитов. Тяжесть заболевания зависит от того, сколько альфа-цепей повреждено. Повреждение всех четырех цепей несовместимо с жизнью, только лишь одной — клинически не выявляется, а HbH клетки отсутствуют вовсе.
Помимо талассемии, существует несколько других заболеваний, возникающих, когда трансляционный аппарат дает сбой. Примером мутаций митохондриальных генов, кодирующих транспортные РНК, являются мутации, приводящие к митохондриальным энцефаломиопатиям (синдром MELAS).
К самым распространенным приобретенным нарушениям транскрипции и трансляции относят недостаточную продукцию аминокислот при недоедании или нарушениях всасывания (квашиоркор, маразм). Такие нарушения синтеза протеинов и аминокислот видны на клеточном уровне: эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи фрагментируются, существенно снижается количество рибосом. Эти изменения часто приводят к недостаточности гормонов щитовидной железы (гипотиреоз) и гормонов роста (при недостаточности передней доли гипофиза).
К посттрансляционным нарушениям относятся нарушения гидроксилирования, гликозилирования, карбоксилирования и ацетилирования протеинов. Нарушения этих процессов приводят к таким патологиям, как, например, CDG-синдром (congenital disorder of glycosylation — врожденное нарушение гликозилирования) и синдром Элерса-Данлоса шестого типа. Примерами приобретенных синдромов, связанных с подобного рода нарушениями, являются недостаточность витаминов К и С. Недостаточный посттрансляционный протеолиз белков также может приводить к нарушениям синтеза коллагена (синдром Элерса-Данлоса седьмого типа).
В обычном случае после всех этих модификаций протеины запасаются в клетке или транспортируются с целью последующего высвобождения. Специальные белки-шапероны участвуют в разрушении неправильно сформированных белков. При недостаточности альфа-1-антитрипсина причиной этому является мутация в гене, представленном в нескольких вариантах. Его М-форма (генотип PiMM, Pi — ингибитор протеазы) считается нормой. Вариант Z (PiZM или PiZZ) встречается при замене лишь одной аминокислоты в позиции 342 этого гена (вместо глутамата — лизин). Это приводит к изменению конформации альфа-1-антитрипсина, который больше не высвобождается из клетки, а накапливается в ней. Из-за нарушения ингибирования секреторных протеаз (например, эластазы) происходит протеолиз нормальных тканей и, как следствие, цирроз печени или легочная эмфизема.
Системы утилизации протеинов, такие как катепсиновая и убиквитиновая, регулируются гормонально. Инсулин, анаболические стероиды, факторы роста и незаменимые аминокислоты тормозят распад протеинов. Глюкагон, кортикостероиды, катехоламины и цитокины (например, фактор некроза опухоли-альфа), наоборот, стимулируют их деструкцию. Усиленный распад протеинов наблюдается при многих патологических состояниях, например, при сепсисе, ожогах, травмах, уремии, ацидозе, инсулинзависимом диабете. Все эти факторы стимулируют убиквитинирование протеинов и их распад с помощью протеасом. Этот процесс регулируется при помощи активации факторов транскрипции, таких, как, например, транскрипционный фактор NF-κB, влияющий на транскрипцию белков протеасом.
Источники:
- Dörner K. Klinische Chemie und Hämatologie: 69 Tabellen;[Taschenlehrbuch]. – Georg Thieme Verlag, 2009.
- Renz H. (ed.). Praktische Labordiagnostik: Lehrbuch zur Laboratoriumsmedizin, klinischen Chemie und Hämatologie. – Walter de Gruyter, 2014.
