Сквозь барьер

Методы лечения, которые позволяют преодолеть гематоэнцефалический барьер, необходимы врачам для терапии разрушительных неврологических симптомов большинства лизосомных болезней накопления.

Когда Тим Кокс впервые использовал фермент-заместительную терапию в лечении пациента, эффект был «словно по волшебству», вспоминает он. Пациент был бизнесменом, вынужденным на пятом десятке уйти в отставку. На момент лечения он был прикован к инвалидному креслу. У пациента были значительно увеличены печень и селезенка, а также он нуждался в постоянных переливаниях крови и тромбоцитов, чтобы оставаться в живых.

Таковы последствия болезни Гоше. Организм не может производить фермент, который разрушает гликолипид глюкоцереброзид. Последний затем в токсических концентрациях накапливается в различных тканях организма. Тогда, четверть века назад, единственным признанным лечением была рискованная трансплантация костного мозга, но ни одна из трех его сестер не подходила. Так Кокс — врач, занимающийся нарушениями метаболизма в университете Кембриджа, Великобритания, — приобрел в Соединенных Штатах самое передовое средство для лечения — фермент, глюкоцереброзидазу, выделенный из плаценты человека — и внутривенно ввел его своему пациенту.

Это было первое в Великобритании использование фермент-заместительной терапии для лечения болезни Гоше, да и результат был впечатляющим. В течение месяца пациент Кокса стал независим от переливаний крови и инвалидного кресла. «Он ни разу не оглянулся назад, и он все еще жив, — говорит Кокс. — Без этого препарата он бы уже давно погиб от кровотечения или развившегося осложнения».

Появление в начале 1990-х фермент-заместительной терапии совершило революцию в лечении болезни Гоше. Оно также дало начало новой эре лекарственной терапии других лизосомных болезней накопления (ЛБН) — группы, объединяющей около 50 генетических состояний, негативно влияющих на способность организма расщеплять специфические молекулы, которые затем накапливаются, создавая серьезные проблемы со здоровьем.

Мы стоим на пороге новых, невероятных возможностей

Сегодня у нас есть возможность проводить фермент-заместительную терапию более дюжины ЛБН. Методы лечения расширены и также включают препараты с другими механизмами действия, такими, как частичная блокировка синтеза проблемных молекул и восстановление функции мутантных ферментов. Но, несмотря на такое расширение терапевтических возможностей, по-прежнему остаются сложности в способе доставки лекарства в центральную нервную систему для осуществления лечения неврологических симптомов, которые являются одним из наиболее разрушительных аспектов множества ЛБН. Исследователи надеются, что некоторые из находящихся в разработке молекул могут безоговорочно преодолеть этот барьер. «Мы стоим на пороге неких новых невероятных возможностей», — говорит Джон Маршал, старший руководящий научный сотрудник биотехнологической компании Sanofi Genzyme в Кембридже, штат Массачусетс.

Новое для старого

Фермент-заместительная терапия — это именно то, что кажется. “Вы возвращаете на место недостающий фактор”, - говорит Пол Харматц, детский гастроэнтеролог детской больницы Окленда в Калифорнии. Он принимал участие в разработке фермент-заместительной терапии для группы ЛБН, известной как мукополисахаридозы.

Но, как это часто бывает, развитие фермент-заместительной терапии произошло частично благодаря случайному открытию. В 1960-х исследователи лаборатории Элизабет Нейфельд, которая сейчас является биохимиком Калифорнийского университета, Лос Анджелес, случайно смешали вместе клетки пациентов с двумя различными мукополисахаридозами: синдромом Гурлер и синдромом Хантера. Удивительно, но оба набора клеток физиологически стали нормальными. Нейфельд и ее коллеги показали, что каждый тип клеток секретирует фермент, которого не хватает другим, и те потребляют фермент своих соседей — концепция, известная как “перекрестная коррекция”.

Этот вывод был рассмотрен Роско Брэди в Национальном институте неврологических расстройств и инсульта США в Бетесде, штат Мэриленд, который уже сделал важные открытия в отношении диагностики и причинных механизмов болезни Гоше. Его команда изменила глюкоцереброзидазу, добавив на её поверхность маннозу, которая помогает ферменту попасть в макрофаги — тип клеток, наиболее повреждаемый болезнью Гоше. И они провели некоторые начальные исследования этой ферментотерапии на людях.

«Раннее внимание к болезни Гоше в контексте фермент-заместительной терапии было очень удачным выстрелом», — говорит Карла Холлак, врач, занимающийся нарушениями метаболизма в Центре лизосом Амстердама в Голландии. У многих пациентов болезнь Гоше медленно прогрессирует и некоторые из ее эффектов обратимы. «Таким образом, существует большое окно возможностей для лечения», — говорит Холлак. Другие ЛБН прогрессируют гораздо быстрее и приводят к необратимому повреждению.

Компания Genzyme (сейчас часть Sanofi Genzyme) сотрудничала с Брэди и развивала его заместительный фермент, создав Ceredase, который был одобрен Администрацией США по пищевым продуктам и лекарственным веществам (FDA) в 1991 году. Выпуск препарата с тех пор прекращен, а сам препарат заменен на Cerezyme, который производят генноинженерные бактерии.

Сегодня фермент-заместительная терапия доступна для болезней Гоше, Фабри и Помпе, для четырех различных форм мукополисахаридозов, а также для дефицита лизосомной кислой липазы. Ведется разработка других препаратов, в том числе для лечения мукополисахаридоза VII типа и для одной из форм болезни Нимана-Пика.

Однако лечение также имеет свои недостатки. Для жизнеобеспечения препарат должен вводиться внутривенно каждые несколько недель. Такой режим обременителен для пациентов. Это дорого, стоимость составляет около 250000 долларов США на одного пациента в год, а производство белков гораздо сложнее, чем низкомолекулярных препаратов. Эффективность варьирует: например, фермент-заместительная терапия более эффективна для болезни Гоше, чем для болезни Фабри, хотя два этих заболевания и связаны с родственными ферментами, они поражают разные системы органов. А некоторые ЛБН не являются хорошими кандидатами на ферментозаместительную терапию во всех случаях. Болезнь Нимана-Пика типа С и ювенильная форма болезни Баттена, например, вовлекают в процесс белки мембран лизосом. Мембранные белки не растворяются в воде, поэтому их сложно выделить и доставить в организм в форме внутривенного раствора.

Эллен Сидрански (слева) исследует шапероны, с помощью которых можно будет лечить ЛБН. Источник: NHGRI/Ernesto Del Aguila

Но, пожалуй, самым большим недостатком фермент-заместительной терапии является то, что белки не могут проходить сквозь гематоэнцефалический барьер, чтобы предотвратить накопление токсичных молекул в нейронах. Некоторые исследователи работают над способами доставки фермент-заместительной терапии непосредственно в центральную нервную систему, к примеру, вводя препараты прямо в головной или спинной мозг. Но это предполагает хирургическое вмешательство для того, чтобы вставить порт для доставки препаратов, который сопряжен с риском инфекции — трудное решение, особенно когда дело касается маленьких детей, которых больше затрагивают неврологические симптомы.

В мозг

Большинство белков имеют слишком большие размеры для того, чтобы проникнуть сквозь гематоэнцефалический барьер, поэтому многие исследователи взамен им изучают низкомолекулярные лекарственные препараты, которые, возможно, имеют больше шансов. Успехи в понимании того, как возникают ЛБН, также способствуют быстрому продвижению вперед. “Мы больше знаем о том, что случилось с этими клетками, и начинаем понимать то, как их можно исправить”, - говорит Беверли Дэвидсон, Заведующий научной стратегией в Детской больнице Филадельфии в Пенсильвании.

Вместо того чтобы заменить неисправные или отсутствующие ферменты, низкомолекулярные препараты лишь укрепляют различные звенья разлаженного механизма. Одним из подходов является уменьшение количества субстрата, которое включает устранение продукции специфической молекулы, или субстрата, который не может быть переработан и, следовательно, накапливается при различных ЛБН. Снижение субстрата — концепция, прочно устоявшаяся в других областях медицины: статины, например, снижают холестерин крови, ингибируя ферменты, вовлеченные в синтез холестерина.

Мы приобретаем знания о том, что случилось с этими клетками и как это можно исправить

Терапия, направленная на снижение количества субстрата, не устраняет продукцию, однако этот эффект нежелателен в любом случае, ведь многие аккумулирующиеся молекулы важны для организма, даже несмотря на то, что они токсичны в больших количествах. Для того чтобы эта терапия сработала, организм должен иметь способ разрушения небольшого количества субстрата, который все же будет присутствовать. “В большинстве случаев лизосомных болезней накопления, у пациентов сохраняется некоторая остаточная активность фермента, - говорит Маршал. - А другие биохимические механизмы могут способствовать утилизации или экскреции этих молекул”.

Два препарата, снижающих количество субстрата, уже представлены на фармацевтическом рынке. Первый — miglustat, который был утвержден в 2002 году для лечения болезни Гоше у людей, которые не получают фермент-заместительной терапии по причине аллергии или невозможности введения препаратов внутривенно. Этот препарат также был одобрен в некоторых странах (но не в США) для лечения болезни Нимана-Пика типа С. В терапии болезни Гоше miglustat не так эффективен, как замещение фермента, к тому же он имеет серьезные побочные эффекты, такие как тремор и гастроинтестинальные нарушения. “Но принцип терапии, направленной на снижение количества субстрата, был продемонстрирован”, - говорит Холлак, который сделал шаг к новой пероральной терапии.

Второй препарат, направленный на снижение количества субстрата при лечении болезни Гоше — eliglustat, который был одобрен два года назад. Он имеет меньше побочных эффектов, чем miglustat и является более эффективным почти так же, как фермент-заместительная терапия. “Он превзошел чьи-либо ожидания”, - говорит Кокс, который провел несколько клинических испытаний препарата miglustat в 1990-х годах, но не был привлечен к разработке eliglustat. Препарат может обладать и другими преимуществами. Исследования на животных позволяют предположить, что eliglustat может помочь предотвратить В-клеточную лимфому и миелому — распространенные разновидности онкопатологии крови, которая часто возникает как осложнение болезни Гоше.

Как miglustat, так и eliglustat довольно удобны тем, что могут приниматься перорально. Но стоимость их высока: годовая стоимость eliglustat аналогична стоимости фермент-заместительной терапии болезни Гоше. И, хотя теоретически низкомолекулярные препараты могут проникать сквозь гематоэнцефалический барьер, ни miglustat, ни eliglustat не надежны в этом вопросе.

Но другие кандидаты находящихся на стадии разработки препаратов, направленных на снижение количества субстрата, могут, наконец, позволить достичь этого. С коллегами в Sanofi Genzyme Маршал работает над молекулой, в настоящее время известной как Genz-682452, который, как было показано в исследованиях на животных, проникает в мозг. «Препарат ингибирует первую ступень синтеза класса молекул, известных как гликосфинголипиды, потому может помочь в лечении некоторых сфинголипидозов, в том числе болезни Фабри, болезни Гоше и болезни Тэя-Сакса», — говорит Маршал. Sanofi Genzyme приступил ко II фазе испытаний препарата для лечения болезни Фабри в прошлом году, а также изучает возможность разработки молекулы для лечения болезни Гоше.

Правый поворот

Третья стратегия для терапии ЛБН — это спасение присутствующих, но подвергшихся мутации ферментов. У многих пациентов (точное процентное соотношение варьируется от одной ЛБН к другой) мутации не влияют на активные центры ферментов, а лишь изменяют их структуру. «Они достаточно активны, нам лишь нужно изменить их конформацию», — говорит Томас Кьеркигард, старший научный сотрудник биотехнологической компании Orphazyme, базирующейся в Копенгагене. Неправильно свернутые ферменты, как правило, довольно быстро разрушаются клетками. Но если их структура может быть изменена правильно, или по-иному стабилизирована таким образом, что она не разрушается, а затем направлена к правильному месторасположению в лизосоме, они по-прежнему могут выполнять свои функции.

Препараты, которые справляются с этой задачей, известны как фармакологические шапероны. Как и препараты, направленные на снижение количества субстрата, шапероны обычно представляют собой небольшие молекулы и, следовательно, также имеют все шансы проникнуть сквозь гематоэнцефалический барьер. Лечение шаперонами возникло недавно, но уже используется в другой медицинской области: два препарата из этой группы ранее были одобрены для лечения муковисцидоза.

«Два типа шаперонов могут быть использованы для лечения ЛБН», — говорит Эллен Сидрански (нейрогенетик из Национального института исследований генома человека в Бетесде, штат Мэриленд): ингибирующие и не-ингибирующие. Ингибирующие шапероны связываются с активным центром целевого фермента и стабилизируют его для дальнейшей транспортировки в лизосомы. Затем в лизосомах они разделяются так, что фермент может выполнять свои функции.

Первый препарат шаперонов для лечения ЛБН появился на Европейском фармацевтическом рынке ранее в этом году. Он обладает только свойствами ингибитора. Препарат известен как migalastat и имеет аналогичную препарату miglustat химическую структуру. Он одобрен для 35–50% людей с болезнью Фабри, которые имеют одну из 269 различных мутаций, что вызывают нарушения фолдинга фермента α-галактозидазы А.

«Проблема с ингибиторными шаперонами в том, что их разработка может включать сложный химический состав и дозирование», — говорит Сидранси. Сейчас она занята поиском не-ингибирующих шаперонов, которые стабилизируют фермент, связываясь с преимущественно неактивным сайтом, так как это облегчает их работу. «Однако, не так просто найти не-ингибирующие шапероны», — говорит она. Ее команда выполнила скрининг библиотеки, содержащей 250000 соединений, и объявила о нескольких перспективных кандидатах.

Используя нейроны и макрофаги, полученные из репрограммированных клеток кожи людей с болезнью Гоше, Сидрански и ее коллеги показали, что один из этих кандидатов — соединение NCGC607, — позволяет мутантной глюкоцереброзидазе проникать в лизосомы и расщеплять аккумулированный глюкоцереброзид. Важно то, что молекула, похоже, пересекает аэрогематический барьер. «В случае болезни Гоше, мы не имеем терапевтической методики для формы заболевания, которая характеризуется поражением мозга, но этот препарат может наконец-то изменить ситуацию», — говорит Сидрански. Ее результаты также свидетельствуют о том, что NCGC607 может даже помочь в лечении гораздо более распространенного неврологического заболевания — болезни Паркинсона.

Однако одним из ограничений терапии шаперонами является то, что большинство из них будет применимо лишь к одной или, возможно, небольшому числу ЛБН или даже просто к специфическим мутациям в случаях индивидуальных ЛБН. При каждой ЛБН возможно возникновение десятков или даже сотен различных мутаций, которые приводят к одинаковым исходам заболевания — непрактично разрабатывать шапероны, которые будут нацелены на каждую них.

Чтобы обойти эту проблему Киркегард исследует препараты, которые активизируют естественные шапероны организма — белки теплового шока. В теории этот подход может помочь в лечении десятков заболеваний, в том числе и множества ЛБН. «Это повсеместно применяемая концепция, в особенности для заболеваний, связанных с нарушениями фолдинга белка», — говорит Киркегард. Ранее в этом году малая фаза I/II испытаний препарата arimoclomol от компании Orphazyme подарила надежду на лечение не-лизосомального заболевания мышц, называемого спорадический миозит с включенными тельцами. Он также тестируется у больных боковым амиотрофическим склерозом.

Источник: журнал Nature

Другие исследователи скептически относятся к столь широким требованиям. «Предыдущие попытки задействовать систему белков теплового шока в лечении болезни Хантингтона — общего нейродегенеративного заболевания, которое предполагает накопление мутантного белка хантингтона, — подарили надежду в исследованиях на клеточных культурах, но клинические результаты были сокрушительны, — говорит Дэвидсон. — Мне сложно представить, как они будут работать во всех случаях лизосомальных болезней накопления». В настоящее время она занимается собственными разработками низкомолекулярной терапии ЛБН, но отказывается называть их класс и механизм действия.

Но Киркегард считает, что arimoclomol, который индуцирует белок теплового шока, известный как HSP70, может быть пригодным для лечения сфинголипидозов. Это происходит потому, что HSP70 внутри лизосомы связывается с жировой молекулой, называемой ВМР, которая, в свою очередь, является кофактором множества разрушающих сфинголипиды ферментов и увеличивает их активность. Таким образом, повышение доступности HSP70 перегружать систему деградации сфинголипидов.

Недавно была начата третья фаза испытаний препарата Orphazyme у детей с болезнью Ниманна-Пика типа С, приблизительно 95% которых имеют мутации, связанные с нарушением фолдинга, и не поддаются терапии шаперонами. В исследование были включены 46 пациентов в Европе и США, оно продлится 1–2 года. Если результаты будут удовлетворительны, компания будет пытаться излечить и другие сфинголипидозы.

Исследователи используют различные подходы, чтобы обнаружить терапевтические методики, которые будут применимы для многих ЛБН. Команда во главе с генетиком Андрэ Баллабио из Телетонского института генетики и медицины в Неаполе, Италия, занимается исследованием того, могут ли манипуляции над главным регулятором функции лизосом, известным как TFEB, повысить активность лизосом и помочь очистить различные создаваемые молекулы.

Другие исследователи пытаются уменьшить производство неполных ферментов, которые, по оценкам Маршалла, являются причиной 10–15% случаев ЛБН. Считывающие и перескакивающие экзон технологии могут обучать клеточные механизмы производства белков игнорировать преждевременные стоп-сигналы в генах, приводящие к усечению ферментов. Одно из соединений — ataluren, который был одобрен в Европе для терапии миодистрофии Дюшена, — исследуется во II фазе клинических испытаний для терапии синдрома Гурлер.

«Красота в том, что многие из этих путей коррекции заболевания комплементарны», — говорит Киркегард. Это значит, что будущее терапии ЛБН может быть связано не с одним конкретным классом препаратов, а с их комбинацией, хотя это потребует снижения стоимости дорогих лекарств. «Но если фермент-заместительная терапия, лечение, направленное на снижение количества субстрата, терапия шаперонами и другие стратегии приведут к небольшим улучшениям, которые затем объединятся, мы сможем обрести очень, очень хорошую терапию для некоторых из этих заболеваний», — говорит Киркегард.

Оригинал

Перевод: Елена Лисицына

Редакция: Александр Табакаев, Николай Лисицкий

Обложка и изображения: Антон Осипенко